Alignement de s

1
Alignement de séquences biologiques

• Objectifs poursuivis
• Alignement de séquences généralités
• Alignement de deux séquences
• Recherche rapide de similarités dans les banques
  de séquences
• Alignement de n séquences (alignement multiple)
• Recherche de motifs dans les séquences

2
Objectifs poursuivis

• Les alignements permettent de comparer des
  séquences biologiques. Cette comparaison est
  nécessaire dans différents types détudes 
• Identification de gènes homologues
• Recherche de contraintes fonctionnelles communes
  à un ensemble de gènes ou de protéines.
• Prédiction de structure (ARN, protéine)
• Prédiction de fonction
• Étude des processus créateurs de variabilité
  entre les séquences.
• Reconstitution des relations évolutives entre
  séquences.
• Choix d'amorces PCR
• Construction de contigs (séquençage)
• ...

3
Analyse comparative des gènes de b-actine de
l'homme et de la carpe
4
Prédiction de structure d'ARN
5
Phylogénie moléculaire
6
Alignement représentation

• Les résidus (nucléotides, acides-aminés) sont
  superposés de façon à maximiser la similarité
  entre les séquences.
• G T T A A G G C G G G A A A
• G T T G C G A G G A C A
• Mutations
• Substitution (mismatch)
• Insertion
• Délétion
• Insertions ou délétions indels (gap).

7
Quel est le bon alignement ?

• G T T A C G A G T T A C G A
• G T T - G G A G T T G - G A
• OU
• G T T A C - G A
• G T T - - G G A
• Pour le biologiste, généralement, le bon
  alignement est celui qui représente le scénario
  évolutif le plus probable
• Autres choix possibles (exemple erreurs de
  séquençage pour la construction de contigs)

8
Fonction de score de similarité

• G T T A A G G C G G G A A A
• G T T G C G A G G A C A
• Score
• Exemple
• identité 1
• mismatch 0
• gap -1
• Score 10 - 4 6

9
Modèle d'évolution (ADN)

• Transition A lt-gt G T lt-gt C
• Transversions autres substitutions
• p(transition) gt p(transversion)
• G T T A C G A G T T A C G A
• G T T - G G A G T T G - G A
• .

10
Matrice de substitution (ADN)

• Gap -1
• G T T A C G A G T T A C G A
• G T T - G G A G T T G - G A
• 1 1 1 -1 0 1 1 1 1 1 .5 -1 1 1
• score 4 score 4.5

11
Modèle d'évolution (protéines)

• Code génétique
• Asp (GAC, GAU) ? Tyr (UAC, UAU) 1 mutation
• Asp (GAC, GAU) ? Cys (UGC, UGU) 2 mutations
• Asp (GAC, GAU) ? Trp (UGG) 3 mutations
• Propriétés physico-chimiques des acides-aminés
  (acidité, hydrophobicité, encombrement stérique,
  etc.)
• Matrices de Dayhoff (PAM), BLOSUM mesures des
  fréquences de substitutions dans des alignements
  de protéines homologues
• PAM 60, PAM 120, PAM 250 (extrapolations à partir
  de PAM 15)
• BLOSUM 80, BLOSUM 62, BLOSUM 40 (basé sur des
  alignements de blocs)

Substitutions conservatrices
12
Matrice de substitution (protéines)

• D (Asp) E(Glu) F(Phe) G(Gly) W(Trp)
• M R D W - G F M R - D W G F
• M R - W D G F M R W D - G F
• Substitutions multiples (exemple D ? E ? D)

13
Pondération des gaps

• TGATATCGCCA TGATATCGCCA
• TGAT---TCCA TGAT-T--CCA
• Gap de longueur k Pénalités linéaires w do
  de k
• do pénalité pour l'ouverture d'un gap
• de pénalité pour l'extension d'un gap

14
Pondération des gaps (plus réaliste)

• Estimation des paramètres sur des alignements
  "vrais" (par exemple basés sur l'alignement de
  structures connues)
• Gap de longueur k
• Pénalités logarithmiques w do de log(k)
• w f(log(k), log(PAM), résidus, structure)
• PAM la probabilité d'un gap augmente avec la
  distance évolutive
• Résidus, structure la probabilité d'un gap est
  plus forte dans une boucle (hydrophile) que dans
  le cœur hydrophobe des protéines

15
Similarité globale, locale
16
Similarité, distance, homologie

• Deux séquences sont homologues ssi elles ont un
  ancêtre commun
• 30 d'identité entre deux protéines gt homologie,
  sauf si
• Fragment similaire court (lt 100 aa)
• Biais compositionnel (régions de faible
  complexité, par exemple riche en Pro, Ala)

17
Le nombre d'alignements

• Waterman (1984) a donné la formule récursive
  permettant de calculer le nombre total
  dalignements possibles entre deux séquences
  comportant m et n résidus 
• Dautre part, Laquer (1978) a démontré que 
• Le nombre total dalignements possibles entre
  deux séquences de même longueur croît de façon
  exponentielle.

18
Algorithmes d'alignement de deux séquences

• Algorithme description d'une suite d'opérations
  pour atteindre un objectif
• Calculer l'ensemble de tous les alignements
  possibles et garder celui de meilleur score
• Trop long (nombre d'alignements f(exp(L))
• Pas efficace (on recalcule souvent les mêmes
  valeurs)
• G T T A C G A G T T A C G A
• G T T - G G A G T T G - G A
• Algorithme de programmation dynamique
• Calcul de proche en proche de l'alignement optimal

19
Définition de la matrice de chemins

• Les alignements peuvent être représentés sous la
  forme dune trajectoire dans une matrice de
  chemins.
• Pour chaque trajectoire on peut calculer un score
  et il faut donc trouver celle qui optimise ce
  score.
• Soit deux séquences A et B de longueurs
  respectives m et n définissant une matrice de
  chemin S. Dans chaque case de cette matrice on va
  stocker S(i, j), le score optimum de la
  trajectoire permettant darriver à cette case.

20
Exemple de matrice de chemin
21
Construction récursive de la matrice

• Soit la case de coordonnées (i, j). Quelle que
  soit la trajectoire retenue, elle passera
  forcément par lune des trois cases la précédant,
  de coordonnées (i1, j), (i1, j1), (i, j1).
• Supposons que lon connaisse les scores optimums
  des trois cases précédentes, dans ce cas la
  valeur optimum du score dans la case (i, j) sera
  égale à 
• Needleman et Wunsh, 1970

22
Bords de la matrice

• Les cases situées sur le bord du haut ou le bord
  gauche de la matrice ne possèdent plus le total
  requis de trois cases précédentes.
• Pour pallier ce problème on ajoute une ligne (0,
  j) et une colonne (i, 0) supplémentaires. Le
  balayage de la matrice ne se faisant plus quavec
  des indices 1 on ne rencontre plus de cases
  nécessitant un traitement particulier.

23
Bords de la matrice (suite)

• La ligne et la colonne supplémentaires doivent
  être initialisées pour pouvoir construire la
  matrice.
• Il existe plusieurs manières de faire selon la
  façon dont on veut comptabiliser les gains ou
  pertes déléments au niveau des extrémités.
• En particulier, il faut savoir si on veut
  pénaliser ou non les éléments terminaux non
  appariés (ce que lon appelle les extrémités
  flottantes).
• - - - A T T C G T A T - - - T C G T
• A T G A T T C G T A T G A T T C G T

24
Bords de la matrice (fin)

• Pénalisation des gaps terminaux
• Pas de pénalisation des gaps terminaux

25
(No Transcript)
26
Identité 1 Mismatch 0 Gap interne -2 Gap
terminal 0
27
(No Transcript)
28
(No Transcript)
29
Alignement local (Smith-Waterman)

• Initialisation des bords de la matrice de chemin
  à 0

30
Temps de calcul et occupation de la mémoire pour
l'alignement de deux séquences de longueur n et m

• Needleman-Wunsh
• Temps O(n m)
• Espace mémoire O(n m)
• Amélioration éliminer les chemins qui
  s'éloignent trop de la diagonale
• Smith-Waterman
• Temps O(n m)
• Espace mémoire O(n m)
• Amélioration de Smith-Waterman
• Temps O(n m)
• Espace mémoire O(n)

31
Dot Plot

• Représentation graphique de régions d'identité ou
  de similarité entre deux séquences
• Utilisation de fenêtres et de seuils pour réduire
  le bruit de fond
• Visualisation des inversion, duplications,
  palindromes

32
(No Transcript)
33
(No Transcript)
34
Recherche rapide de similarités dans les banques
de séquences

• Comparaison d'une séquence à toute une banque de
  données de séquences, comparaisons entre deux
  banques
• Algorithmes exhaustifs (Smith-Waterman)
• DAP, BLITZ, SSEARCH,
• Algorithmes basés sur des heuristiques
• FASTA
• 1 - recherche de  k-tuplets  identiques
• 2 - alignement global, ancré sur la région
  similaire
• BLAST
• 1 - recherche de  mots  similaires
• 2 - extension des blocs similaires

35
BLAST
36
Alignement par bloc ou alignement global
comparaison BLAST / FASTA
37
Stratégies de recherche de similarités ADN ou
protéine ?

• Limites des recherches de similarité au niveau
  ADN
• Alphabet réduit (4 lettres)
• Dégénérescence du code génétique
• Mais tout n'est pas codant
• régions régulatrices, ARN structuraux, ...

Deux brins!
38
Différentes versions de BLAST adaptées à
différents problèmes

• blastp protéine/protéine
• blastn ADN/ADN (utile pour non-codant)
• blastx ADN-traduit/protéine (utile pour
  séquences codantes non-identifiées plus sensible
  que blastn)
• tblastn protéine/ADN-traduit (utile pour
  rechercher des homologues de gènes protéiques
  dans un génome non-entièrement annoté plus
  sensible que blastn)

39
Choix de la matrice de substitutions

• Différentes matrices de substitutions, adaptées à
  différentes distances évolutives
• BLOSUM 62 convient pour une large gamme de
  distances évolutives
• Combiner plusieurs matrices

40
Évaluation statistique de la similarité

• Parmi les similarités qui ont été détectées,
  quelles sont celles qui reflètent des relations
  biologiquement importantes, quelles sont celles
  qui sont simplement dues au hasard ?
• Distribution des scores d'alignements locaux
  optimaux entre séquences non homologues
• Probabilité qu'une similarité de score S soit
  simplement due au hasard

Nombre d'occurrences
Score
41
Traitement du bruit de fond filtres et masques

• Similarités sans intérêt biologique
• Séquences de faible complexité (protéines, ADN)
• 40 des protéines ADN microsatellites
• 15 du total des résidus exemple
  CACACACACACACACACA
• Ala, Gly, Pro, Ser, Glu, Gln
• logiciels de filtrage SEG, XNU, DUST
• RSPPR--KPQGPPQQEGNNPQGPPPPAGGNPQQPQAPPAGQPQGPP
• . .
• QGPPRPGNQQCPPPQGG--PQGPPRP--GNQQRP--PPQGGPQGPP
• Séquences abondantes
• 3000 Immunoglobulines dans GenBank
• 106 Alu, 105 L1 dans le génome humain
• logiciels de masquage XBLAST, RepeatMasker

42
Bilan quelle approche adopter ?

• algorithme
• matrices de substitution, pondération des gaps
• stratégie de recherche (nucléique, protéique)
• traitement du bruit de fond
• complétude des banques de données
• 1 - logiciel rapide, paramètres par défaut
• 2 - filtrage éventuel
• 3 - changement des paramètres (matrices, W, k,
  etc.)
• 4 - changement d'algorithme
• 5 - répéter la recherche régulièrement

43
Alignement multiple programmation dynamique

• La généralisation de lalgorithme précédent au
  traitement simultané de plus de deux séquences
  est théoriquement possible mais inexploitable en
  pratique.
• Pour un alignement de n séquences le nombre de
  chemins possibles pour chaque case est de 2n 1.
• On a une croissance exponentielle du temps de
  calcul et de l'espace mémoire requis en fonction
  du nombre de séquences.
• Problème du choix d une fonction de score
• Utilisation de méthodes heuristiques.

44
Alignement progressif

• Approche consistant à construire itérativement
  lalignement multiple en groupant des alignements
  de paires de séquences.
• Ce genre de méthodes comporte trois étapes 
• Lalignement des paires de séquences.
• Le groupement des séquences.
• Le groupement des alignements (alignement
  progressif).
• CLUSTAL (Thompson et al., 1994), le programme
  dalignements multiples le plus utilisé à lheure
  actuelle utilise cette approche.

45
(No Transcript)
46
Pénalités initiales pour les gaps

• CLUSTAL utilise une fonction de pénalité linéaire
  pour les gaps. De plus, les valeurs initiales de
  do et de sont corrigées en fonction de nombreux
  facteurs 
• Le degré de similarité entre les séquences 
• do µ identité(A, B)
• La longueur des séquences 
• do µ logmin(m, n)
• La différence de longueur entre les deux
  séquences 
• de µ 1.0 logn/m
• Ces pondérations sont prises en compte au moment
  de lalignement des paires de séquences.

47
Pénalités en fonction de la position

• CLUSTAL introduit également des pondérations qui
  sont dépendantes de la position des gaps.
• Diminution de la pénalité à lemplacement de gaps
  préexistants.
• Augmentation de la pénalité au voisinage (8
  résidus) de gaps préexistants.
• Réduction de la pénalité au niveau de régions
  contenant des suites dacides aminés hydrophiles
  ( 5 résidus).
• Modification spécifiques en fonction des acides
  aminés présents (e.g., la pénalité est plus
  faible avec Gly, Asn, Pro).
• Ces pondérations sont prises en compte au moment
  du groupement des alignements.

48
Alignement progressif pas toujours optimal

• Un seul des ces trois alignements est optimal

49
Global Alignments, Block alignments
50
DialignMorgenstern et al. 1996 PNAS 9312098

• Search for similar blocks without gap
• Select the best combination of consistent similar
  blocks (uniforms or not) heuristic (Abdeddaim
  1997)
• Alignment anchored on blocks
• Slower than progressive alignment, but better
  when sequences contain large indels
• Do not try to align non-conserved regions

51
Local Multiple Alignments

• MEME
• MATCH-BOX
• PIMA

52
Overview

• ClustalW
• Dialign
• T-coffee
• MEME

53
Éditeur d alignement multiple
54
Special cases

• Alignment of coding DNA sequences
• L F L F
• CTT TTC CTT TTC
• CTC --- --- CTC
• L - - L
• alignment of protein sequences
• back-translation of the protein alignment into a
  DNA alignment
• Alignment cDNA / genomic DNA SIM4
• Alignment protein / genomic DNA GeneWise

55
Limits of pairwise comparison (BLAST, FASTA, ...)

• Seq A CGRRLILFMLATCGECDTDSSE
  HICCIKQCDVQDIIRVCC
• 
  
• Insulin CGSHLVEALYLVCGERGFFYTP
  EQCCTSICSLYQLENYCN
• Seq B YQSHLLIVLLAITLECFFSDRK
  KRQWISIFDLQTLRPMTA
• Pairwise comparison
• Insulin / Seq A 25 identity
• Insulin / Seq B 25 identity

56
Insulin gene family sequence alignment

• B-chain
  A-chain
• INSL4 Q14641 ELRGCGPRFGKHLLSYCPMPEKTFTTTPGG...
  x58 ....SGRHRFDPFCCEVICDDGTSVKLCT
• INSL3 P51460 REKLCGHHFVRALVRVCGGPRWSTEA.......
  x51 ....AAATNPARYCCLSGCTQQDLLTLCPY
• RLN1 P04808 VIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS..........x
  109 ....PYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC
• BBXA P26732 VHTYCGRHLARTLADLCWEAGVD..........x
  25 ........GIVDECCLRPCSVDVLLSYC
• BBXB P26733 ARTYCGRHLADTLADLCF--GVE..........
  x23 ........GVVDECCFRPCTLDVLLSYCG
• BBXC P26735 SQFYCGDFLARTMSILCWPDMP...........x
  25 ........GIVDECCYRPCTTDVLKLYCDKQI
• BBXD P26736 GHIYCGRYLAYKMADLCWRAGFE..........x
  25 ........GIADECCLQPCTNDVLLSYC
• LIRP P15131 VARYCGEKLSNALKLVCRGNYNTMF........
  x58 ........GVFDECCRKSCSISELQTYCGRR
• MIP I P07223 RRGVCGSALADLVDFACSSSNQPAMV......
  .x29 ....QGTTNIVCECCMKPCTLSELRQYCP
• MIP II P25289 PRGICGSNLAGFRAFICSNQNSPSMV......
  .x44 ....QRTTNLVCECCFNYCTPDVVRKYCY
• MIP III P80090 PRGLCGSTLANMVQWLCSTYTTSSKV.......
  x30 ....ESRPSIVCECCFNQCTVQELLAYC
• MIP V P31241 PRGICGSDLADLRAFICSRRNQPAMV.......x
  44 ....QRTTNLVCECCYNVCTVDVFYEYCY
• MIP VII P91797 PRGLCGNRLARAHANLCFLLRNTYPDIFPR...
  x86 ..EVMAEPSLVCDCCYNECSVRKLATYC
• ILP P22334 AEYLCGSTLADVLSFVCGNRGYNSQP.......
  x31 ........GLVEECCYNVCDYSQLESYCNPYS
• INS P01308 NQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT.....
  x35 ........GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
• IGF1 P01343 PETLCGAELVDALQFVCGDRGFYF.........
  x12 ........GIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLK
• IGF2 P01344 SETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYF.........
  x12 ........GIVEECCFRSCDLALLETYCATPA

57
Biomolecular Sequence Motif Descriptors

• Exact word e.g. EcoRI restriction site GAATTC
• Consensus e.g. TATA box TATAWAWR
• Regular expression e.g. insulins PROSITE pattern
  
• C-C-P-x(2-4)-C-STDNEKPI-x(3)-LIVMFS-x(3)-C
  
• Weight matrix position-specific weighting of
  substitutions
• Generalised profiles (hidden markov models)
  position-specific weighting of substitutions and
  indels

58
Example of weight matrix

• Splice donnor sites of vertebrates frequency ()
  of the four bases at each position
• log transformation ? weight matrix
• Base Position
• -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6
• A 33 60 8 0 0 49 71 6 15
• C 37 13 4 0 0 3 7 5 19
• G 18 14 81 100 0 45 12 84 20
• T 12 13 7 0 100 3 9 5 46
• Cons. M A G G T R A G T

59
Searching for distantly related homologues in
sequence databases

• 1- search for homologues (e.g. BLAST)
• 2- align homologues (e.g. CLUSTAL, MEME)
• 3- compute a profile from the multiple alignment
• 4- compare the profile to a sequence database
  (e.g. MAST, pfsearch)
• pfsearch http//www.isrec.isb-sib.ch/profile/prof
  ile.html
• MEME/MAST http//meme.sdsc.edu/meme/website/

60
PSI-BLAST

• Position-Specific Iterated BLAST
• 1- classical BLAST search
• 2- compute a profile with significant BLAST hits
• 3- BLAST search based on the profile
• 4 -repeat steps 2-3 up to convergence
• More sensitive than Smith-Waterman
• 40 times faster

61
Comparison of a sequence to a database of protein
motifs

• Databases PROSITE, PFAM, PRODOM, , INTERPRO
• Search tools
• ProfileScan http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCA
  N