Pr

1
19 septembre 2007 Luc Paillard, CNRS UMR
6061 Luc.paillard_at_univ-rennes1.fr
Modalités de contrôle post-transcriptionnel
cytoplasmique
2
Que sont les régulations post-transcriptionnelles?
AAAAAA
AAAAAA
3
Que sont les régulations post-transcriptionnelles?
(Régulation de la stabilité des protéines)
Régulation de la traduction
AAAAAA
Régulation de la stabilité des ARNm
AAAAAA
Un niveau de contrôle de la concentration cellulai
re en chaque protéine
4
 How is gene expression controlled in
eukaryotes? As in prokaryotes, control is exerted
primarily at the level of transcription 
Lubert Stryer, Biochemistry III, 1988
5
Des altérations de facteurs de régulation post-tra
nscriptionnelle provoquent des perturbations
phénotypiques
Importance du contrôle post-transcriptionnel chez
les eucaryotes
Des pathologies humaines sont associées à des
défauts de contrôle post-transcriptionnel
6
Des altérations de régulations post-transcriptionn
elles provoquent des perturbations phénotypiques
Mise en place de laxe antéro-postérieur chez la
drosophile
7
Des pathologies humaines sont associées à des
défauts de contrôle post-transcriptionnel
Thalassémies (a ou b) et instabilité des ARNm a
ou b globine Oncogenèse et stabilisation dARNm
de cytokines/proto-oncogènes
8
Des approches systématiques destimation de
lampleur des régulations post-transcriptionnelles
?
Transcriptome (puce, SAGE) niveau
daccumulation des ARNm Transcription, stabilité
des ARNm
9
Des approches systématiques destimation de
lampleur des régulations post-transcriptionnelles
?
Transcriptome (puce, SAGE) niveau
daccumulation des ARNm Transcription, stabilité
des ARNm
 Traductome  (gradient) Accumulation des ARNm
dans les polysomes Traduction des ARNm
10
Des approches systématiques destimation de
lampleur des régulations post-transcriptionnelles
?
Transcriptome (puce, SAGE) niveau
daccumulation des ARNm Transcription, stabilité
des ARNm
 Traductome  (gradient) Accumulation des ARNm
dans les polysomes Traduction des ARNm
Protéome (2DE, MS et dérivés) niveau
daccumulation des protéines Traduction,
stabilité des protéines
11
Des approches systématiques destimation de
lampleur des régulations post-transcriptionnelles
?
Transcriptome (puce, SAGE) niveau
daccumulation des ARNm Transcription, stabilité
des ARNm
 Traductome  (gradient) Accumulation des ARNm
dans les polysomes Traduction des ARNm
Protéome (2DE, MS et dérivés) niveau
daccumulation des protéines Traduction,
stabilité des protéines
Relations Transcriptome/traductome/Protéome
12
1. Levures en phase de croissance
Marquage métabolique (Met-35S) des
cellules Séparation des protéines par 2DE
Quantification des spots, identification
Niveaux dexpression de 106 protéines
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
13
1. Levures en phase de croissance
Données de SAGE
Niveaux dexpression des ARNm correspondants
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
14
1. Levures en phase de croissance
Corrélation entre niveau dexpression des ARNm et
des protéines
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
15
1. Levures en phase de croissance
Corrélation entre niveau dexpression des ARNm et
des protéines
Corrélation très mauvaise!
Gygi et al MCB 1999 19, 1720
16
2. Réponse à un changement de milieu de culture
Culture de levures en galactose Transfert en
galactose ou éthanol Ratio Gal/Eth mesuré pour
245 produits de gènes protéine (ICAT MS en
conditions quantitatives), ARNm
(microarray) log du ratio des protéinesf(log du
ratio des ARNm) (log0 pour un produit de gène
dont labondance ne change pas)
Griffin et al MCP 2002 1, 323
17
2. Réponse à un changement de milieu de culture
R20.21!
Griffin et al MCP 2002 1, 323
18
Conclusion

• Les régulations post-transcriptionnelles sont un
  niveau
• MAJEUR de régulation de lexpression génétique
• 2. (En conséquence, les analyses
  transcriptomiques
• peuvent être insuffisantes)

19
Bref survol des modalités de régulations
post-transcriptionnelles
Structure de l'ARNm eucaryote
AUG
STOP
AAA.AAA
5'
3'
ORF
5'UTR
3'UTR
Coiffe
Queue poly(A)
Régions non codantes
20
Rappels sur la traduction eucaryote
Initiation
Recrutement de la petite sous-unité ribosomique
(40S) à l extrémité 5  Scanning jusqu à la
rencontre de l AUG initiateur Jonction de la
grosse sous-unité (60S) ribosome (80S)
Elongation
Lecture codon par codon
Terminaison
Relargage du peptide Le ribosome? Influence du
contexte du codon stop
21
La 5UTR contrôle la traduction 1, Les uORF
(upstream ORF)
5UTR de lARNm Gcn4 de levure
4 uORF avant lATG initiateur
Réinitiation possible  dans certaines
conditions  en 3 dune uORF Ces conditions
contrôlent la traduction de GCN4
Gaba et al EMBO J 2001 20, 6453
22
La 5UTR contrôle la traduction 1, Les uORF
(upstream ORF)
Plusieurs (nombreux) ARNm contiennent des uORF,
même chez les métazoaires Fonction???
23
La 5UTR contrôle la traduction 2, Fixation dune
protéine dans la 5UTR
La fixation dune protéine à proximité de la
coiffe (lt40nt) inhibe la traduction Exemple
Contrôle de la traduction de la ferritine par la
séquence IRE et la protéine IRP
24
La 5UTR contrôle la traduction 3, Les IRES
(Internal Ribosome Entry Site)
Initiation indépendante de la coiffe (et de
eIF4E) Traduction de certains ARNm quand les
autres sont réprimés (stress, cycle cellulaire)
25
La 3UTR contrôle la stabilité 1, Le récepteur de
la transferrine
L'IRP (Iron Response Protein) lie l'IRE (Iron
Response Element) si la concentration cellulaire
de fer libre est faible LARNm récepteur de la
transferrine contient 5 IRE dans sa 5UTR (et un
site de clivage endonucléolytique)
Complexe IRE-IRP inhibition de
dégradation Contrôle de la concentration
intracellulaire en fer libre
26
La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U
Rich Element)
Mise en évidence 1986. ARNm de cytokines,
proto-oncogènes
Cinétique de dégradation, en Northern, dun ARNm
rapporteur sous contrôle dun promoteur inductible
Sans ARE
Avec ARE
Xu et al. MCB 2001 21, 6960
27
La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U
Rich Element)
3 classes dARE
Classe Exemple Description
I c-fos, c-myc (AUUUA) répartis
II GM-CSF, TNFa (AUUUA) chevauchants
III c-jun Pas de (AUUUA)
28
La 3UTR contrôle la stabilité 2, Les ARE (A/U
Rich Element)
Les ARE agissent en fixant une protéine (ARE-BP)
hnRNPD/AUF1, HuR, TTP Effet positif ou négatif
de la fixation de la protéine
29
La 3UTR contrôle la stabilité 3, La queue poly(A)
Un ARNm polyadénylé est généralement plus stable
quun ARN désadénylé
30
La 3UTR contrôle aussi la traduction 1, Les ARE
(A/U Rich Element)
Vecteur vide
EGFP-ARE
EGFP
Transfection dun plasmide codant un ARN
EGFP (avec ou sans ARE dans la 3UTR)
Mesure de lARN (Northern) et de la protéine
(western) EGFP
Grosset et al. JBC 2004 279, 13254
31
La 3UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue
poly(A)
/-cap
/-poly(A)
Luciferase
Incubation dans extrait de levure
Même expérience en présence d anticorps anti PABP
Mesure de luminescence
Pas de stimulation de la traduction par la queue
poly(A)
Tarun et Sachs (1995) Genes Dev 9, 2997
32
La 3UTR contrôle aussi la traduction 2, La queue
poly(A)
/-cap
/-poly(A)
Luciferase
Transfection dans les levures
Mesure de luminescence
"wt"
Dpab1
La queue poly(A) stimule la traduction de façon
dépendante de la PAB1
Searfoss et al 2001, MCB 21, 4900
33
Mais tout cela est lié! 1, ARE et état
dadénylation
Cinétique de dégradation, en Northern, dun ARNm
rapporteur contenant un ARE sous contrôle dun
promoteur inductible
Diminution de taille avant dégradation
Peng et al. MCB 1996 16, 1490
34
Mais tout cela est lié! 2, ARE, état
dadénylation, traduction, stabilité

ARE-BP
AUG
STOP
5'
AAAA...AAAAA
ARE
-
Ri

(et cest encore pire)
35
La 3 UTR contrôle la traduction ET la stabilité
Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non
codants Une histoire récente
Et alors?
miRNA
RNAi
siRNA
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
36
Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non
codants Une histoire récente
Mécanismes biochimiques
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
37
Biosynthèse des miRNA
Reconnaissance dun ARN double brin par Argonaute!
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
38
Fonction des miRNA
LARN simple brin (22nt) shybride à un
ARNm cible ( target ), et entraîne Argonaute
sur cet ARN
1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt
Conséquence inhibition de la traduction de
lARNm cible Voie miRNA  classique  chez
lanimal
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
39
Fonction des miRNA
LARN simple brin (22nt) shybride à un
ARNm cible ( target ), et entraîne Argonaute
sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt
Conséquence dégradation de lARNm cible Voie
miRNA  classique  chez la plante
Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519
40
Fonction des miRNA
LARN simple brin (22nt) shybride à un
ARNm cible ( target ), et entraîne Argonaute
sur cet ARN
2. Hybridation sur la totalité des 22 nt
Conséquence dégradation de lARNm cible Voie
miRNA  classique  chez la plante Mais si
lon apporte un ARN double brin
parfaitement complémentaire dun ARNm cible chez
lanimal, cela provoque sa dégradation voie
 siRNA  chez lanimal
41
Mise en évidence du RNAi
Injection d'ARN sens, antisens ou double brin
dans la gonade
Phénotype de la descendance?
Prix NOBEL 2006
Fire et al. (1998) Nature 391, 806
42
Reprenons
miRNA ARN double brin (222nt) codé par le
génome de la cellule (sous forme dun précurseur
qui est maturé) Environ 200 chez
lhumain Sapparie imparfaitement à un ARN cible
et inhibe sa traduction (animal), ou sapparie
parfaitement et provoque sa dégradation (plante)
(Il y a des exceptions) En général, un miRNA
sapparie aux 3UTR dun ou plusieurs ARNm Une
3UTR peut être liée par plusieurs miRNA siRNA
ARN double brin (222nt) apporté par
lexpérimentateur dans une cellule
animale Sapparie parfaitement à un ARNm cible
et provoque sa dégradation
43
Le RNAi, un mode de régulation post-transcriptionn
el au service de lexpérimentateur Application en
thérapeutique?
Downward BMJ  2004 328, 1245