Diapositive 1

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La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse
Midi-Pyrénées
Bernard Monsarrat IPBS/CNRS
http//proteomique.ipbs.fr http//www.genotoul.fr
RIO
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Proteomics Platform
Toulouse Midi-Pyrénées
RIO Label
From proteins
to function

BioinformaticsSQL-LIMSMascotIn-house software
Technical Skills
Biomolecular Interactions Biacore 3000, X
2D Gel Electrophoresis
ScannersTyphoon
Quantitative Proteomics ABI Q-STAR
http//proteomique.ipbs.fr
RobotizationPackard Multiprobe II
Posttranlational ModificationsABI Q-TRAP
Peptide SequencingProtein CharacterizationThermo
Fisher Orbitrap
Peptide Mass Fingerprinting ABI MALDI Tof-Tof
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La Plateforme Génopole Toulouse Midi-Pyrénées
ICR
IFR 31
IFR 109
IPBS
IFR 40
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The Proteomics Platform - Staff
Renaud Albigot - Bioinformatics David Bouyssié -
PhD in Bioinformatics Emmanuelle Mouton -
Bioinformatics Karima Chaoui - Biochemistry and
Mass Spectrometry Florence Dalvai - Biochemistry
and Mass Spectrometry Carine Froment -
Biochemistry and Mass Spectrometry Carole
Pichereaux - Biochemistry and Mass Spectrometry
Michel Rossignol - Biochemistry and Mass
Spectrometry Alexandre Stella - Biochemistry and
Mass Spectrometry Ludovic Canelle - Post-doc,
Marie-Pierre Bousquet - Researcher Anne Gonzalez
de Peredo Researcher Bernard Monsarrat
Coordination Mariette Matondo - PhD student Odile
Schiltz Researcher Sandrine Uttenweiler
Researcher J.P. Estève and F. Lopez (IFR 31),
F. Pont (IFR 30), P. Valenti (IFR 109), A. Cuider
(ICR)
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Challenges in Proteomics
Patterson, S.D. Aebersold, R.H (2003) Nature
Genetics
Interacting Proteins
Post-Translational Modifications
Differential Proteomics
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• 2006-2007
• Mise en place dune nouvelle génération
  dinstruments
• - LTQ-FT-Orbitrap
• Développement de nouvelles stratégies
• - Identification de protéines de faible abondance

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Un spectromètre de masse hybride de nouvelle
génération LTQ-FT-Orbitrap

• Mass resolution gt 60,000 (FWHM) at m/z 400 at 1
  sec cycle
• Max. resolution gt 100,000 at m/z 400 in a full
  scan
• Mass accuracy lt 5 ppm external calibration (2
  days old)
• lt 2 ppm internal calibration (lock mass)
• Mass range 50 2,000 200 4,000
• Sensitivity sub-femtomol on column
• Dynamic range 3000 in a single scan
• Throughput 3 accurate mass scans per second
  or 4 scans per second
  parallel detection (1 HR Orbitrap scan
  3 LR LTQ MS/MS scans)

IPBS Toulouse Inst 15/09, Recept. 20/10 -2006
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Mouvement des ions dans lOrbitrap
comment maintenir des ions stables, dans un
champ électrostatique
Dr. Alexander Makarov,
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Paramètres affectant le degré de couverture dun
protéome
100mg total protein lysate ?100 copy/cell ? 20
fmol
de Godoy et al. Genome Biol. 2006
Eucaryotic cells 105 -106 Biological fluids
1010 (serum) Red blood cell 97-98
haemoglobin 2 other proteins
Low abundance peptides not picked for MS/MS 60
Trap filled with 5.106 ions Detection of signal
500 ions Dynamic range 104
Reduction de la gamme dynamique ?
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ETUDE DU PROTEOME CACHE DE LERYTHROCYTE PAR
LIGANDS PEPTIDIQUES COMBINATOIRES ET LC-MS/MS SUR
LTQ-FT-ORBITRAP
 Equalization des érythrocytes 
Echantillon protéique Large gamme dynamique RBC
98 dhémoglobine
Eluat Réduction de la gamme dynamique
64 millions de ligands peptidiques
Flow-Through Majeure partie des protéines de
haute abondance
Collaboration E. Boschetti (RD), BioRad
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 Equalization des érythrocytes 






































































SE-Beads
E-Beads
E-Beads
SE-Beads
RBC lysat fraction Soluble
-COOH
-NH2
Elution TUC
Elution TUC
Organic elution
Start
Organic elution
FT
Elution UH
Elution UH
E1
E3
S1
S3
E2
S2
SDS-PAGE analytique
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 Equalization des érythrocytes 






































































E1E2E3S1S2S3
Start
N spots 80 (1300 ?g) Silver staining
N spots 950 (640 ?g) Silver staining
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Analyse par nanoLC-MSMS LTQ-FT-Orbitrap
Start 2mg E1 100µg E2 100µg E3 100µg S1
100µg S2 100µg S3 total
SDS-PAGE gel Cut 20 bands per sample
Trypsin digestion
NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap 1 MS Orbitrap
reso60000 5 MSMS Ion trap (Data Depedent
Acquisition)
MFPaQ Protein Validation False Postive Rate
0.7
Mascot 2.0 Search in IPI human
MFPaQ Bouyssié et al. Mol. Cell. Prot., 2007
Effet de lEqualization sur MS/MS des peptides ?
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Effect of equalization on high abundance proteins
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Before equalization
After equalization
Number of identified peptides decreases after
equalization More time for minor peptides
sequencing
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Effect of equalization on low abundance proteins
Hepatoma-derived growth factor
Before equalization
After equalization
Number of identified peptides increases after
equalization sequencing of additional proteins
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Avant versus Après  Equalization 
Après Equalization E1E2E3S1S2S3
fractions 1587 proteins
Avant Equalization  Start  fraction 540
proteins
NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap
Identifications 1647 proteines ! Pasini et al
MCP 2006 252
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Evolution des approches protéomiques
? Analyse systématique
Identification de l'ensemble des protéines d'un
système
? Analyse fonctionnelle

• Interactions protéine/protéine

Caractérisation des partenaires protéiques au
sein dun complexe

• Modifications post-traductionnelles

• Analyse différentielle (Bioinformatique)

Quantification relative d'un ensemble de
protéines dans deux conditions distinctes
? Analyse fonctionnelle ciblée
(Bioinformatique)

• Etude différentielle de sous-protéomes
• Quantification absolue de protéines dintérêt

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Remerciements

• Réseau National des Génopoles
• CNRS,
• Région Midi-Pyrénées

• Pôle de Compétitivité Cancer Bio Santé
• Cancéropole GSO, INCa
• FRM, ANR

CPER 2007_2013, Protéomique 5.2 M