LA%20M

1
LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE
2
Plan

• I - Vue générale de la phase M
• II - Mitose
• III - Cytocinèse

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II Mitose
4
Mitose fuseau mitotique

• Émanation du cytosquelette microtubules
  protéines associées
• Séparation des chromosomes filles vers les pôles
• Ecartement des pôles

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2 événements

• Fuseau dans le cytoplasme
• Condensation des chromosomes dans le noyau
• Prométaphase mélange des deux compartiments ?

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Les microtubules

• Capturent les chromosomes
• Intervention des moteurs
• Proches des extrémités des microtubules
• Famille des kinésines ( ? extrémité )
• Famille des dynéines ( ? extrémité -)
• Extrémités des microtubules
• Site dassemblage et de désassemblage des
  microtubules
• Lieu de production de force
• Fuseau
• Équilibre entre les deux forces opposées (moteurs
  et moteurs -)

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Les trois classes de microtubules

• MT astraux
• Irradient dans toutes les directions
• Séparation des pôles
• Poignées dorientation et de positionnement du
  fuseau dans la cellule
• MT du kinétochore
• Liés au kinétochore
• Fixent les chromosomes au fuseau
• MT chevauchant (polaires)
• Symétrie bipolaire du fuseau

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Fig 18-10

• Les trois classes de microtubules
• MT astraux
• MT du kinétochore
• MT chevauchant (polaires)
• Toutes les extrémités sont vers le centrosome

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Rappel sur les microtubules interphasiques

• Réseau de microtubules émanant du centrosome
• Instabilité dynamique
• Croissance ? raccourcissement catastrophe
• Raccourcissement ? Croissance restauration

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Plan

• Prophase
• Modification de la stabilité des microtubules
  équilibre MAPs ? catastrophines
• Assemblage du fuseau équilibre moteurs à
  direction ? moteurs à direction -
• Prométaphase
• Métaphase
• Anaphase
• Télophase

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A Prophase

1. Modification de la stabilité des microtubules
   équilibre MAPs ? catastrophines
2. Assemblage du fuseau équilibre moteurs à
   direction ? moteurs à direction -

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1 - Modification de la stabilité des microtubules
équilibre MAPs ? catastrophines
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Changement brutal des microtubules en prophase
le constat

• Longs et peu nombreux (interphase) ?
• Plus nombreux et plus courts
• Effondrement de la demi-vie des microtubules
• Augmentation de linstabilité des microtubules
• Augmentation du nombre de microtubules irradiant
  du centrosome
• Par modification des centrosomes qui augmentent
  leur taux de nucléation

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Fig 18-11

• Les microtubules mitotiques sont différents des
  microtubules interphasiques

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Protocole détude

• Cellule en culture (lignée PTK1 et BSC) injectée
  avec tubuline-fluorochrome (dichlorotriazinyl-amin
  ofluorescein (DTAF-tubulin))
• Irradiation avec un rayon laser dune petite
  surface jusqu'à extinction de la fluorescence
• Evaluation de la réapparition de la fluorescence
  en fonction du temps

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Saxton, WM J Cell Biol 992175, 1984

• FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase
  and an interphase cell. Examples of relative
  fluorescence intensity plotted against time after
  photobleaching for a metaphase cell (?) and an
  interphase cell (?). Circles represent data
  points determined by microdensitometry of
  negatives. Lines represent best fitting curves
  using the function l/lmax 1 e kt (30). The
  t½ for each curve is noted on the X axis.

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Changement brutal des microtubules en prophase
mécanisme de déclenchement en début de mitose

• M-Cdk phosphoryle
• Des moteurs protéiques
• Des MAPs (Microtubule Associated Proteins) (leur
  phosphorylation ? diminution de la stabilité des
  microtubules)
• ? contrôle de la dynamique des microtubules
• Démonstration par biochimie chez Xenopus

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Xenopus

• Extrait dœuf de Xenopus en phase M ou en
  interphase
• Centrosome tubuline fluorescente ?
• Nucléation des microtubules à partir des
  centrosomes
• (Analyse en vidéo microscopie à fluorescence
  time-lapse )
• Mais 1p1038
• Extraits mitotiques ? taux très élevé de
  catastrophes
• Extraits interphasique ? taux plus bas de
  catastrophes

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Les catastrophines

• Protéines
• Augmentent la fréquence des catastrophes

20
Les catastrophines
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Fig 16-55

• Kinésines et Kinesin-related proteins
• KIF2
• moteur au milieu de la chaîne lourde
• pas d'activité moteur classique
• se lie aux extrémités des microtubules pour
  augmenter leur instabilité dynamique ? nom de
  catastrophine

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Antagonisme catastrophines / MAPs
23
Antagonisme catastrophines / MAPs

• Microtubules plus dynamiques en phase M
• Par action sur catastrophines et MAPs ?
• Augmentation du taux de dépolymérisation des
  microtubules (catastrophines)
• Diminution du taux de dépolymérisation des
  microtubules (MAPs)
• Augmentation et diminution du taux de
  dépolymérisation des microtubules

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Fig 18-12(A)

• Contrôle de la longueur des microtubules par
  l'équilibre entre catastrophines et MAPs

Catastrophes avec extraits mitotiques gt
catastrophes avec extraits interphasiques
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Fig 18-12(B)

• Centrosomes et noyaux de spermatozoïdes dans des
  extraits mitotiques
• Extraits mitotiques normaux ? fuseau normal
• Déplétion en XMAP215 ? fuseau très anormal
• Probablement parce que les microtubules nucléés
  par les centrosomes sont trop courts

Mitose dans un extrait normal
Mitose dans un extrait dépléte en XMAP215
26
Régis Tournebize, Andrei Popov, Kazuhisa
Kinoshita, Anthony J. Ashford, Sonja Rybina,
Andrei Pozniakovsky, Thomas U. Mayer, Claire E.
Walczak, Eric Karsenti  Anthony A. Hyman Control
of microtubule dynamics by the antagonistic
activities of XMAP215 and XKCM1 in Xenopus egg
extractsNature Cell Biology  2, 13 - 19 (2000)

• Spindle formation observed in control and
  XMAP215-depleted extracts. Microtubule arrays
  are seen in control (left) and XMAP215-depleted
  (right) extracts 20 and 45 min after addition of
  sperm nuclei. Spindles are seen 45 min after
  sperm addition. Scale bar represents 10 µm.

20 mn
20 mn
45 mn
45 mn
Les fuseaux deviennent visibles 45 min après
lajout des spermatozoïdes
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2 - Assemblage du fuseau équilibre moteurs à
direction ? moteurs à direction
28
Propriétés des microtubules

• Si monomérique le moteur se déplace
• Si multimérique liaison de 2 microtubules
  adjacents qui peuvent se déplacer lun par
  rapport à lautre
• Génération de foyers à extrémités moins ? pôles
  du fuseau
• Glissement de microtubuleslun par rapport à
  lautre ?zone de chevauchement dansle fuseau

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Fig 18-13

• Importance des moteurs multimériques pour
• Assemblage
• fonctionnement des microtubules

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Assemblage du fuseau équilibre

• Croissance de microtubules à partir de chaque
  centrosome ? les microtubules ont des polarités
  opposées
• Association de moteurs à déplacement ?
• Écartent les centrosomes
• Des moteurs à déplacement - ?
• Rapprochent les centrosomes
• Formation du fuseau équilibre entre les deux

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Fig 18-14

• Prophase séparation des pôles du fuseau grâce à
• des moteurs (kinésine) rencontre de deux
  microtubules polaires de polarité opposée
• des moteurs (dynéine) associés à lenveloppe
  nucléaire via les microtubules astraux

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Fig 18-14

• Prophase séparation des pôles du fuseau grâce à
• des moteurs (kinésine) rencontre de deux
  microtubules polaires de polarité opposée
• des moteurs (dynéine) associés à lenveloppe
  nucléaire via les microtubules astraux

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Régulation de la longueur du fuseau les moteurs
du fuseau

• Vertébrés 7 familles de moteur apparentés à la
  kinésine
• S. cerevisiae 5 familles de moteur
• Augmentation du moteur ? fuseau anormalement
  long
• Augmentation du moteur - ? fuseau anormalement
  court

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Fig 18-15

• L'influence de moteurs à sens de marche opposé
  sur la longueur du fuseau mitotique
• Kar 3p moteur vers -
• Cin 8p moteur vers

Normal ?moteur - ? fuseau court ? moteur
? fuseau long
Chez la levure il ny a pas de rupture de
lenveloppe nucléaire pendant la
mitose Fuseau Pôles du fuseau
35
Chez lhomme

• Probablement comme chez la levure
• La phosphorylation dau moins un moteur par M-Cdk
  est nécessaire pour la fixation du moteur au
  fuseau

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B Prométaphase

• Rupture soudaine de lenveloppe nucléaire
• Déclenchée par la phosphorylation directe des
  lamines nucléaires par M-Cdk
• Les microtubules accèdent aux chromosomes pour la
  1ère fois

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Conséquences

• Phénomène de  recherche et capture  des
  chromosomes par les microtubules
• Un microtubule qui rencontre un chromosome
  sattache et se stabilise ? plus (zéro) de
  catastrophes
• Peut rencontrer un kinétochore
• Sattache par lextrémité (bout du microtubule)
• Le microtubule sappelle alors  microtubule du
  kinétochore 

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Fig 18-16

• Les microtubules du kinétochore

1 à 40 microtubules par kinétochore
ADN les 2 kinétochores
39
(No Transcript)
40
Les kinétochores
41
Fig 18-19

• Microscopie électronique d'un kinétochore

Structure trilamellaire
42
Kinétochore

• Rôle capital dans le mouvement des chromosomes
  sur le fuseau
• Contiennent des moteurs et des moteurs
• Mode dattachement des microtubules aux
  kinétochores inconnu (dautant plus que ce bout
  se polymérise et se dépolymérise constamment)

43
Kinétochore
44
Microtubule Capture A Concerted Effort Chitra
Kotwaliwale and Sue Biggins Cell, Volume 127,
Issue 6 , 15 December 2006, Pages 1105-1108

• Attachement du kinétochore aux microtubules et sa
  régulation par Aurora B
• Le kinétochore structure protéique qui se forme
  au contact de lADN centromérique-est composé de
  multiples protéines de liaison de faible affinité
  au microtubule. Alors que le complexe Ncd80 se
  lie à la charpente en réseau du microtubule,
  dautres composants peuvent se lier à lextrémité
  plus du microtubule.
• En réponse à des forces de tension, Aurora B
  phosphoryle les protéines de liaison au
  microtubule pour diminuer laffinité de ces
  facteurs aux microtubules. Ceci conduit au
  détachement des microtubules des kinétochores.
  Des facteurs comme INCENP-survivine peuvent
  exercer de nombreuses fonctions au niveau du
  kinétochore. En plus de leur rôle de senseurs de
  tension régulés par Aurora B, ces molécules
  peuvent aussi promouvoir une activité de liaison
  au noyau du microtubule

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Kinétochore

• The kinetochore is a specialized chromosomal
  structure that facilitates chromosome attachment
  and movement along spindle microtubules during
  chromosome segregation. Furthermore, the
  kinetochore communicates the actual state of its
  interaction with the spindle to a cell cycle
  regulating machinery. It is the first member of a
  signaling cascade that inhibits sister chromatid
  separation (the beginning of anaphase) if
  chromosomes lack a stable bi-polar spindle
  attachment. A defect in this checkpoint function
  has been correlated to human cancers. My group
  analyses the protein composition and structure of
  the S. cerevisiae kinetochore by mass
  spectroscopy and the function of individual
  kinetochore proteins applying cell and molecular
  biological methods.

46
Kinétochore

• Hierachical Structure of the Yeast Kinetochore
• A small CEN DNA interacts with CBF3, an inner
  kinetochore complex that recruits a specialized
  nucleosome. Together these complexes recruit
  multiple discrete protein complexes, ultimately
  resulting in a large structure that mediates the
  attachment and movement of chromosomes on the
  mitotic spindle.

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Attachement des microtubules aux kinétochores

• Facile à observer dans les cellules de poumon de
  têtard
• Liaison par le côté du microtubule
• Puis glissement rapide vers le centrosome
• Puis lattachement latéral est converti en
  fixation par lextrémité
• En même temps attachement de lautre kinétochore
  par les microtubules du centrosome opposé ?
• Attachement bipolaire du chromosome

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Fig 18-17

• Capture des microtubules par les kinétochores

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Constitution de la plaque métaphasique

• Les chromosomes sont tirés davant en arrière ?
• Position équidistante des pôles ?
• Plaque métaphasique

50
Fig 18-18

• Plaque métaphasique chromosomes
• Kinétochores
• Microtubules

51
Plaque métaphasique

• Oscillation des chromosomes
• en attendant le signal de la séparation
• qui est le dernier signal négatif émis par le
  dernier kinétochore

52
C - Métaphase
53
PAUSE
54
Fig 18-20

• Dynamique des microtubules du fuseau métaphasique
• rhodamine - tubuline en rouge
• colorant bleu pour l'ADN
• Fluorescéine (caged) - tubuline en vert

1,5 mn
Fluorescéine invisible parce que  cagée 
2,5 mn
 décageage  de la fluorescéine par UV juste à
gauche de la plaque métaphasique
55
Fig 18-21

• Microscopie à fluorescence de microtubules isolés

56
Fig 18-22

• Alignement des chromosomes sur la plaque
  métaphasique par des forces opposées

57
Fig 18-23

• Assemblage du fuseau sans centrosome dans un
  embryon parthénogénétique d'insecte Sciara
  (absence d'aster)

58
D - Anaphase

• Anaphase A
• Anaphase B

59
Fig 18-24(A)

• Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome
  ni kinétochore
• Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence
  d'extrait d'oeuf de Xenopus

60
Fig 18-24(B)

• Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome
  ni kinétochore
• Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence
  d'extrait d'oeuf de Xenopus

61
Fig 18-25

• Séparation des chromatides en anaphase
• Microtubules colorés par des AC anti tubuline
  marqués à l'or

62
Fig 18-25A

• Forces qui séparent les chromosomes en anaphase A

63
Fig 18-25B

• Forces qui séparent les chromosomes en anaphase B

64
Fig 18-27

• Deux modèles de migration du kinétochore vers le
  pôle pendant l'anaphase A

65
Fig 18-28

• Diminution de la zone de chevauchement des
  microtubules chevauchant de la métaphase à
  l'anaphase chez les diatomés

66
Fig 18-29

• Fonctionnement des moteurs protéiques pendant
  l'anaphase