La Real Time PCR

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La Real Time PCR
Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie
Diagnostiche

• Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la
  biologia molecolare

Francesca Schena
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Un po di storia...

• Test ad alta
• SENSIBILITA
• SPECIFICITA

• 1983 Kary Mullis ideò la PCR
• 1993 premio Nobel

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LA END-POINT PCR

• LIMITI
• Poca precisione
• Bassa risoluzione
• No automazione
• Prodotti a basso p.m.
• Bromuro di etidio non è quantitativo ed è
  mutageno
• Risultati non numerici

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QUANTIFICAZIONE NON E PRECISA A PLATEAU MA LO E
NELLA FASE ESPONENZIALE
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In una PCR con misurazione end-point (gel di
agarosio) la quantità di ampliconi rilevato non è
proporzionale alla quantità di target iniziale
In una PCR Real Time il numero di cicli
necessario per raggiungere una certa quantità di
ampliconi è proporzionale alla quantità di target
iniziale
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Come funziona la Real Time?
UTILIZZA DIVERSE SONDE INTERNE AL TARGET MARCATE
A FLUORESCENZA CHE VENGONO RILEVATE DAI
TERMOCICLATORI (FLUORIMETRI) DURANTE LA REAZIONE
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Vantaggi della PCR Real Time

• Si evitano le contaminazioni date dalla
  manipolazione del campione
• Si riduce il tempo dellesperimento
• Si ha una quantificazione del prodotto in tempo
  reale

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La quantificazione del prodotto

• QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA tramite curve standard a
  concentrazione nota

• QUANTIFICAZIONE RELATIVA tramite curve standard
  di un gene calibratore

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SYBER GREEN
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Perchè non scegliere SYBER Green
Perchè scegliere SYBER Green

• Non sono richieste sonde specifiche
• Generale screening di trascritti prima di
  passare alle sonde
• Metodiche di pcr già collaudate in assenza di
  prodotti aspecifici, dimeri di primers ecc.

• Genotipizzazione
• Multiplex
• Amplificazione di trascritti poco espressi
• Detection di un basso livello di patogeni

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Le sonde TaqMan
REPORTER
QUENCHER
TAQ POLYMERASE
PHOSPHATE
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Le sonde TaqMan
DETECTED EMISSION
EXCITATION
NON DETECTED EMISSION
EXCITATION
AMPLICON
AMPLICON
Extension
5-3 Exonuclease
Annealing
REPORTER
QUENCHER
TAQ POLYMERASE
PHOSPHATE
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VantaggiTaqman
SvantaggiTaqman

• AFFIDABILITA
• SICUREZZA
• SEMPLICITA
• PRODUTTIVITA

• COSTO ELEVATO
• PROBLEMI DI ACCUMULO

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MULTIPLEX
SMART CYCLER
Quattro canali ottici per la rilevazione della
fluorescenza Possibile utilizzo di SYBR Green,
FAM, ROX, Cy3, Cy5, Texas Red, TET, Scorpion e
Amplifluor primer
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Molecular Beacon
A target-specific loop
B stem (5-6 complementary bases)
EXCITATION
C fluorophore
Quenching
NON FLUORESCENT QUENCHER
SI UTILIZZANO DI PREFERENZA CON LAPPARECCHIATURA
NULISENS EASYQ
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Vantaggi

• INNOVAZIONE prima utilizzata per il monitoraggio
  di paziente HIV positivo approvata dalla FDA
• SEMPLICITA per linterfaccia Windows che
  consente una facile interpretazione dei dati

Svantaggi

• Massima precisione solo con RNA ottenuti da
  estrattori automatici
• Complessità della metodica

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Sonde Fret
Phosphate
Fluorescein (donor)
LC RED640/705 (acceptor)
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Genotipizzazione tramite la curva di melting
Sonda 136 V
A
V
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Sonde fret e LIGHT CYCLER
Ottimo in diagnostica Perchè molto veloce!!
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Termociclatore Tipo di sonda -
ABI PRISM 7700 Non versatile Set-up Ingombrante produttivo Syber green Economico Versatile Metodica collaudata Aspecificità Multiplex Tipizzazione
ABI PRISM 7700 Non versatile Set-up Ingombrante produttivo Taqman/ Affidabile semplice Costoso
Smart Cycler Set-up piccolo e pratico Taqman Syber green Molecular beacon Multiplex Veloce (8 min) Flessibile Diagnostica Protocollo rigido Ricerca
Nuclisens EasyQ Molecular beacon Tipizzazione Diagnostica Metodica complessa
Light Cycler Fret Syber green Tipizzazione Veloce Diagnostica Costoso Non per grossi volumi
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Applicazioni
Quantificazione virale Quantificazione
dellespressione genica Quantificazione del danno
al DNA Controllo di qualita Efficacia e
monitoraggio di una terapia Detection di
patogeni Genotyping