La m

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La méthode enzymatique de séquençage, dite de
(Sanger didésoxy)

• Méthode de synthèse partielle basée sur l'arrêt
  de la synthèse par l'incorporation de
  didésoxynucléotides
• Nécessite
• Brin simple matrice
• Amorce
• ADN polymérase (Klenow)
• Déoxynucléotides
• Didéoxynucléotides

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(No Transcript)
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d                                               
                                                  
                           
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(No Transcript)
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Le séquençage automatique
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Sens de la lecture sur un autoradiogramme
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Recherche de la phase ouverte de lecture ou cadre
de lecture ouvert (ORF open reading frame)
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Clonage de l'ADN génomique
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Utilisation du phage lambda comme vecteur de
clonage
La partie centrale du phage lambda n'est pas
nécessaire pour la réplication ou
l'encapsidation Environ 15 kb
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Autres vecteurs de clonage

• 1) Cosmides
• Hybride phage / plasmide
• Peut cloner environ 45 000 bases
• 2) Phage à brin simple, p. ex., M13
• Phage à ADN circulaire (7.2 kb) Brin double dans
  E. coli Brin simple à l'extérieur d'E. coli
• Production de brin simple des gènes clonés pour
  le séquençage (avant les techniques de séquençage
  par RPC)
• 3) Vecteurs d'expression
• Plasmides où le gène cloné est transcrit et
  traduit en protéine
• 4) YAC - Chromosome artificiel de levure
• Télomères et centromère
• Peut cloner environ 500 000 bases
• 5) BAC - Chromosome artificiel de bactérie
• Construit à partir du facteur F
• Peut cloner environ 200 000 bases

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Comment repérer ou identifier le clone contenant
le gène voulu?
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A noter que, ce protocole peut-être utilisée avec
des plages de lyse ou des colonies. Incubation
de la membrane de nitrocellulose avec une sonde
radioactive. La sonde radioactive est un fragment
dADN spécifiquement complémentaire à lADN du
gène recherché. La sonde est marquée à la
radioactivité ou par fluorescence. Encore faut-il
préparer une sonde spécifique au gène recherché!
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Comment obtenir des sondes spécifiques?
Hybridation des brins d'ADN complémentaires.
1) Sonde à partir du gène d'une autre espèce2)
Sonde à partir d'ADN complémentaire

CCGTAC sonde
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• Sonde d'ADN synthétique
• Sonde d'ADN synthétisée à partir de la
  connaissance des acides aminés d'une protéine
  produite par le gène utilisation du code
  génétique

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Synthétiseur doligonucléotides
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Oligonucléotides

• On peut synthétiser des fragments d'ADN de 10 à
  100 bases de longs.
• On peut les rendre radioactifs et s'en servir
  comme sondes. On se sert de transférase terminale
  pour ajouter des dNTPs ayant du 32P sur leur
  phosphate gamma
• ACTGCTGATCGTAGCTAAAA

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• Autre type de sondes les sondes d'anticorps

La protéine est détectée à l'aide d'un anticorps
primaire qui reconnaitera spécifiquement la
protéine étudiée, puis dun anticorps secondaire
fluorescent et qui sattachera à lanticorps
primaire.
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Comparaison de deux vecteurs de clonage (1976
versus 1982)
Des fragments grands jusquà environ 10kb peuvent
être clonés.
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Construction d'une librairie de clones

• 109 Fragments/EcoRI 109 Plasmides/EcoRI
• Ligation
• 108 Plasmides Recombinants 1010 cellules
• Transformation
• 10 x 106 Cellules ayant un plasmide recombinant
  colonies blanches en présence de X-GAL
• 90 x 106 Cellules ayant un plasmide
  non-recombinant colonies bleues en présence de
  X-GAL
• 99 900 x 106 Cellules n'ayant aucun plasmide
  pas de colonies en présence d'ampicilline

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Clonage par positionnement - Arpentage du
chromosome (marche sur le chromosome)
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Buvardage (transfert) de Southern
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Hybridation avec une sonde radioactive lors d'un
transfert de Southern
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Buvardage (transfert) Northern

• Transfert capillaire servant à déceler la
  présence d'un ARN déterminé
• Différences comparé à un Southern
• 1 - Pas d'enzyme de restriction
• 2 - Le gel contient une substance dénaturante
  pour empêcher la formation de structure
  secondaire
• ARN 1 seul brin
• 3 - Pas de dénaturation et neutralisation du gel
  avant le transfert
• Similairement, le transfert servant à détecter la
  présence d'une protéine est appelé Western blot.
  Dans un Western, La protéine est détectée à
  l'aide d'un anticorps primaire qui reconnaitera
  spécifiquement la protéine étudiée, puis dun
  anticorps secondaire fluorescent et qui
  sattachera à lanticorps primaire.

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(No Transcript)
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Problème de carte de restriction

• Un chromosome linéaire de phage est marqué au 32P
  à ses deux extrémités et digéré par lenzyme
  EcoRI. Ceci produit des fragments de 2.9, 4.5,
  6.2, 7.4 et 8.0 kb. Une autoradiographie dun
  buvardage à la Southern du gel contenant ces
  fragments montre que la radioactivité est
  associée aux fragments de 6.2 et de 8.0 kb.
• Lenzyme BamHI coupe le même ADN en fragments de
  6.0, 10.1 et 12.9 kb. Dans ce cas le marquage est
  associé aux fragments de 6.0 et de 10.1 kb.
• Lorsque EcoRI et BamHI sont utilisés ensemble les
  fragments obtenus mesurent 1.0, 2.0, 2.9, 3.5,
  6.0, 6.2 et 7.4 kb.

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(No Transcript)
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• A) Dessinez la carte de restriction de cette
  molécule par ces deux enzymes en y indiquant les
  positions relatives et les distances.
• B) Une sonde radioactive préparée à partir dun
  gène X cloné de ce phage est ajoutée à un filtre
  obtenu par buvardage dun gel contenant lADN du
  phage, cette fois non marqué, digéré par les
  enzymes pris séparément. Lautoradiographie
  montre quil y a hybridation avec les fragments
  de 4.5, 10.1 et 12.9 kb. Dessinez la localisation
  du gène X sur votre carte.

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(No Transcript)