Microbiolog

1
Microbiología General

• Seminario Nro. 1
• Esterilización y Bioseguridad

2
Algunos conceptos básicos...

• Esterilización eliminación o muerte de todos los
  microorganismos que contiene un objeto o
  sustancia.
• Bactericida Agentes que destruyen y matan a las
  bacterias
• Bacteriostático Agentes que inhiben el
  crecimiento de las bacterias
• Desinfectante agente que elimina la carga
  microbiana total en superficies inanimadas tales
  como mesadas de trabajo.
• Antiséptico agente que controla y reduce la
  presencia de
• microorganismos potencialmente patógenos
  sobre piel y/o mucosas

3
Esterilización
Criterio de muerte para un microorganismo Perdid
a irreversible de su capacidad de reproducción
4
Cinética de Muerte de un MO
La muerte de microorganismos como consecuencia de
un tratamiento a altas temperaturas sigue una
cinética exponencial.
5
Cinética de Muerte de un MO
6
VALOR D Tiempo de reducción decimal
Se define el valor D como el tiempo necesario
para que el número de supervivientes caiga al 10
del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para
que el logaritmo del número de supervivientes se
reduzca en una unidad).
El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí
el subíndice t) de forma que a mayores
temperaturas el valor de D es menor, es diferente
para distintos microorganismos, distintos
entornos y diferentes condiciones fisiológicas.
7
VALOR D Tiempo de reducción decimal
8
Efecto de la Temperatura
A que temperatura es menor el valor de D?
9
D es un parámetro de la sensibilidad de un
Microorganismo determinado al efecto de la
temperatura
log nº MO viables
100
A
Cuál es el MO más sensible al tratamiento?
10
B
1
C
tiempo
10
VALOR Z
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el
valor de D disminuye de forma logarítmica. De
manera análoga a como el valor D indicaba el
tiempo necesario para lograr que el número de
supervivientes se redujera al 10 de la población
inicial, el valor z indica el incremento en la
temperatura (medida en número de grados)
necesario para que el valor D se reduzca a la
décima parte del inicial.
donde ?T es el incremento de temperatura, y DT1 y
DT2 los valores de D a las dos temperaturas
estudiadas.
11
Efecto de la Temperatura sobre características de
los alimentos
12
Efecto de la carga inicial (No)
13
Esterilización en Microbiología de
Alimentos Desde el punto de vista de la salud
alimentaria, se suele requerir un tratamiento 12D
de los productos susceptibles de ser portadores
de gérmenes patógenos (o que puedan dar lugar a
intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12
órdenes de magnitud el número de supervivientes o
bien, visto de otra forma, reduce en un factor de
10-12 la probabilidad de supervivencia de un
microorganismo dado. Si consideramos que un solo
microorganismo contaminaba una unidad (una lata,
por ejemplo) del alimento inicial, después de un
tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una
lata contaminada se reduce hasta 10-12.
14
Clostridium botulinum
D121 0.20 min No 3.5 x 10 5 ufc/lata Tiempo
de tratamiento a 121C 2 min NF ?
3.5 x 10 15 ufc/ lata
15
Valor D1 minuto
Log 10
6
105
Recuento de viables
5
4
3
B
2
A
1
0
0
Probabilidad de sobrevivientes
Tiempo (min)
1
4
2
3
5
6
7
?1
?2
?3
?4
?5
?6
Log 10
16
Log 10
12
Recuento de viables
10
8
MO A D1 min a 121 ºC
6
4
2
0
Probabilidad de sobrevivientes
1
4
2
3
5
6
7
Tiempo (min)
MO B D0.5 min a 121 ºC
Log 10
17
Ejercicios

• Si se ha determinado que para esporas de
  Clostridium botulinum suspendidas en buffer
  fosfato el D121 0.204 min, Cuánto tiempo
  llevaría reducir una población de 1012 esporas de
  C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a
  121C?
• Para el mismo sistema se sabe que el valor Z
  10ºC. Cuánto tiempo llevaría reducir una
  población de 1012 esporas de C. botulinum en
  buffer fosfato a 1 espora a 111C?
• La leche cruda a la entrada de la planta de
  procesamiento tiene una carga bacteriana de
  4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a 79ºC por
  21 segundos. Si el valor D promedio para la
  población bacteriana a 65ºC es de 21 segundos y
  el valor Z es de 7ºC, cuántos microorganismos
  quedarán luego del tratamiento a 79ºC?Cuánto
  tiempo se requeriría para lograr el mismo grado
  de letalidad a 65ºC?Cuánto tiempo llevaría
  reducir la concentración a 1ufc/100ml con un
  tratamiento a 65ºC?

18
Agentes Físicos

• CALOR
• RADIACIONES
• FILTRACIÓN

19
Calor

• Calor húmedo
• Calor seco

Ambos pueden ser utilizados en procesos de
esterilización
20
Calor húmedo

• PROCESOS
• Esterilización
• Vapor saturado a presiones mayores que la
  atmosférica
• Tindalización (fraccionada por vapor)
• Pasteurización
• UHT
• MECANISMOS DE ACCIÓN
• Desnaturalización de proteínas
• Destrucción de ácidos nucleicos

21
Pasteurización

• LHT (low temperature holding)
• 30 minutos a 62.8ºC
• HTST (high temperature short time)
• 15 segundos a 71.6ºC
• Solo destruye patógenos (Coxiella burnetti,
  Mycobacterium tuberculosis, etc.) y reduce flora
  de deterioro.
  NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIÓN
• Usos leche, lácteos, jugos de fruta

Louis Pasteur
22
UHT (Ultra high temperature)

• 140ºC-150ºC durante pocos segundos
• Proceso continuo
• Necesita envasado aséptico
• Si es un proceso de esterilización

23
Tindalización

• 100 ºC 30 min, 3 días sucesivos
• Proceso discontinuo con períodos de incubación
  intercalados
• Usos esterilización de productos de baja
  resistencia térmica, cuando no existe otra opción

John Tyndall
24
Vapor saturado a presiones mayores que la
atmosférica

• Condiciones Vapor saturado a temperaturas
  mayores de 100ºC
• (PRECAUCIÓN eliminación total del aire)
• Equipo Autoclave
• Alcance Se puede conseguir esterilización
• Usos Esterilización de materiales y productos
  termoestables ( salvo productos oleosos y
  polvos). Descontaminación de desechos biológicos.
  

25
Autoclave
26
Autoclave

• Condiciones
• 121ºC durante 15 minutos, con cargas iniciales
  bajas
• 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales
  altas
• Indicadores
• Físicos Temperatura y/o presión
• Químicos
• Indicador biológico Geobacillus
  stearotermophilus
• (D 121ºC1.5 minutos)
• Tamaño del inóculo 104 esporas

27
Perfil de temperatura de un proceso de
esterilización por calor húmedo
28
Calor Seco

• Mecanismo de acción Procesos de oxidación
• Controles de proceso de esterilización
• Indicadores físicos y químicos
• Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis
  var. niger
• (D 160ºC 0.3 a 1.8 min, Z20ºC, tamaño del
  inóculo ?105 esporas)

29
Calor Seco

• Aire caliente
• EquipoHornos eléctricos
• Alcance Se consigue esterilización (170ºC, 60
  minutos o 160ºC, 120 minutos)
• Usos
• a) Esterilización de
• Materiales resistentes al calor
• Sustancias no miscibles en agua (inyectables
  oleosos, siliconas, vaselina líquida)
• Polvos
• b) Despirogenizacion (250ºC 45 minutos o 180ºC
  4hs, o 650 1 min)

30

• Incineración
• Destrucción de material
• contaminado

Flameado Desinfección
31
Resistencia a calor
RESISTENCIA

• Priones
• Endosporas bacterianas
• Mycobacteria
• Virus sin envoltura lipídica
• Hongos
• Bacterias
• Virus con envoltura lipídica

_
32
Esterilización por filtración
La esterilización por filtración se logra por el
paso de un líquido o un gas a través de un
material capaz de retener los microorganismos
presentes. La esterilización por filtración se
emplea para materiales sensibles al calor, tales
como ciertos medios de cultivo, azúcares,
soluciones de antibióticos y otros medicamentos,
etc.
33
Filtros de profundidad Estos filtros están
elaborados por un material fibroso (papel,
asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de
manera que dentro de la estructura del filtro se
crean vías tortuosas donde pueden quedar
retenidos la mayoría de los contaminantes
presentes.
Filtros de superficie Son filtros elaborados
generalmente de acetato de celulosa o nitrato de
celulosa y contienen poros de tamaño uniforme.
Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al
conocer exactamente el tamaño de poro que
presentan, se pueden seleccionar filtros capaces
de retener la totalidad de los microorganismos
presentes en una solución. Sin embargo, se
saturan rápidamente y la velocidad de filtración
a través de ellos es lenta. La mayor parte de
los filtros de membrana se pueden esterilizar en
autoclave y luego se manipulan asépticamente al
ensamblar el equipo.
34
FILTRACIÓN DE AIRE

• Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)
• Remoción de hasta el 99.97 de partículas mayores
  de 0.3 micrones de diámetro
• Se usan en cabinas o habitaciones de flujo
  laminar
• CONTROL
• Retención Mínima de un 99.97 de partículas
  generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato)
  en caliente con un diámetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con número de
partículas controlado FLUJOS LAMINARES
AREAS DE TRABAJO
35
Cabinas de Flujo Laminar Vertical
Salida de aire
Protege la muestra, el operador y el medio
ambiente
Entrada de aire
36
Esterilización por radiaciones
Baja energía
Actividad antimicrobiana
Alta energía
Dos tipos Radiaciones ionizantes
Radiaciones no ionizantes
37
Radiaciones Ionizantes

• Características
• Alta energía, baja longitud de onda
• Gran poder de penetración
• Ionizan átomos y moléculas
• No requieren altas temperaturas
• Tipos
• Rayos gamma (60Co o 137Cs)
• Rayos catódicos (electrones acelerados)
• Partículas beta

38

• Mecanismos de acción
• Formación de radicales libres
• Daño al ADN, ARN
• Resistencia
• Priones
• Deinococcus radiodurans
• Enterococcus faecium
• Esporas bacterianas
• Virus
• Hongos
• Bacterias (en gral)

D (kGy) m.o. 3
Bacillus pumilus 1.2 Staphylococcus
spp.
39
DesventajasEquipo especial, personal
entrenadoNo todos los materiales resisten el
tratamientoReacciones no deseadas en alimentos
40
Radiaciones no Ionizantes

• Características
• Baja energía, sin poder ionizante
• Sin poder penetrante
• Máxima eficiencia biocida a 260nm
• Mecanismos de acción
• Sitio blanco ADN
• Formación de dímeros de timina
• Usos
• Desinfección de superficies
• Desinfección de aire y agua

NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA
41
ESTERILIZACIÓN POR RADIACION UV
Luz ultravioleta La radiación ultravioleta
producida artificialmente en el espectro de 250
nm ha sido utilizada por su actividad germicida
esterilizante por más de 30 años. La acción de
los rayos ultravioleta se debe a la producción de
ozono que logra la asepsia, ya que este gas
conserva su acción inhibidora hasta una dilución
de 1 x 40.000. Los aminoácidos aromáticos de las
proteínas y las bases puricas y primidinicas, en
particular la timina del DNA, son los principales
compuesto blancos afectados por la acción
bactericida de la acción ultravioleta. Evitando
la replicación de las tiras del DNA o causando
recombinaciones que terminan en mutaciones
mortales.
Dímeros de timina
42
Procesos de esterilización
43
Control de Esterilización

• Controles del proceso
• Indicadores Físicos
• Químicos
• Biológicos

• Post-proceso

TEST DE ESTERILIDAD !!!
44

• Controles del proceso

Indicador físico Ej
Temperatura, presión
Indicador químico Cambio de color
Indicador biológico Microorganismo
resistente
45
Agentes químicos de esterilización y control del
crecimiento
Antisépticos Alcoholes Iodo Órgano-Mercuriale
s Colorantes Desinfectantes y/o
Esterilizantes Cloro y
Compuestos clorados Aldehídos Oxido de
Etileno Compuestos Fenólicos
46

• Lesionan la membrana celular de los
  microorganismos y desnaturalizan proteínas.
  Desorganizan la estructura fosfolipídica de la
  membrana.
• No destruyen esporas y tienen una acción
  germicida lenta.
• Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto
  nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan
  en concentraciones del 50 al 70.
• Los más utilizados son el etanol e isopropílico.
• Es un agente oxidante que modifica grupos
  funcionales de proteínas y ácidos nucleicos.
  Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los
  grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos
  amino, indoles, etc.
• Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura
  de iodo yodo molecular 2 y yoduro de sodio 2
  en alcohol), aunque es irritante.
• Es efectivo contra esporas en una concentración
  de 1600 ppm de iodo libre

Alcoholes
Iodo
47

• Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y
  formadora de radicales libres.
• Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se
  está utilizando como desinfectante de superficies
  o decontaminante de gabinetes biológicos debido a
  que no posee las propiedades tóxicas y
  cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído.

Peróxido de Hidrógeno
Órgano-Mercuriales

• Estos tipos de compuestos se combinan con los
  grupos -SH de las proteínas, inactivando
  enzimas.
• Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran
  el metafen y el mertiolate.

48
Colorantes
Los derivados del trifenilmetano (violeta de
genciana, verde de malaquita y verde brillante)
bloquean la conversión del ácido
UDP-acetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido.
R HSO4- Verde BrillanteR Cl- Verde de
Malaquita
Violeta de Genciana
49
Cloro y sus derivados
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son
desinfectantes que actúan sobre proteínas y
ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan
grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al
hidroxifenol de la tirosina. El producto clorado
más utilizado en desinfección es el hipoclorito
de sodio (agua lavandina), que es activo sobre
todas las bacterias, incluyendo esporas, y además
es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de
sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al
Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es
diluido en agua.
El hipoclorito de sodio se comercializa en
soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro
activo) y Generalmente, se utilizan soluciones
con una concentración del 0.1-0.5 de Cloro
activo. Su actividad está influida por la
presencia de materia orgánica
50
Aldehídos

• Son agentes alquilantes que actúan sobre
  proteínas, lo que provoca modificación
  irreversible de enzimas e inhibición de la
  actividad enzimática.
• Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes.
  Destruyen esporas.
• El glutaraldehído es el único esterilizante
  efectivo en frío.
• El formaldehído como gas se utiliza para
  descontaminar edificios, ambientes, etc.
• El formaldehído gaseoso se obtiene por
  calentamiento del paraformaldehído tiene la
  desventaja de ser muy irritante y perder
  actividad en ambientes refrigerados.

Glutaraldehido
Formaldehido
Paraformaldehido
51
Oxido de Etileno

• Es un agente alquilante que se une a compuestos
  con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos
  carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
  
• Es utilizado en la esterilización gaseosa,
  generalmente en la industria farmacéutica. Sirve
  para esterilizar material termosensibles como el
  descartable y plástico, equipos electrónicos,
  bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso

52
Compuestos Fenólicos

• Son desinfectantes que provocan lesiones en la
  membrana citoplasmática porque desordenan la
  disposición de las proteínas y fosfolípidos.
• El fenol no es usado a menudo como desinfectante
  por su olor desagradable, por ser muy irritante y
  por el resido que queda luego de tratar las
  superficies.
• Los derivados del fenol más utilizados son el
  hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los
  cresoles (alquil fenoles). Estos son muy
  efectivos a bajas concentraciones contra formas
  vegetativas de bacterias. No son efectivos contra
  esporas.

Coeficiente del fenol
53
(No Transcript)
54
BIOSEGURIDAD
55
Bioseguridad

• Contención primaria protección del personal y
  del medio ambiente inmediato del laboratorio de
  la exposición a agentes infecciosos.
• Contención secundaria Protección del medio
  ambiente externo al laboratorio de la exposición
  a materiales infecciosos
• Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los
  equipos de seguridad incluyen gabinetes de
  seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados,
  y otros controles de ingeniería destinados a
  eliminar o minimizar las exposiciones a
  materiales biológicos peligrosos.
• Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras
  Secundarias)
• Riesgo Biológico Es la probabilidad de sufrir
  cualquier tipo de infección, alergia, o toxicidad
  por una exposición no controlada a agentes
  biológicos.

56
Niveles de Bioseguridad
Bioseguridad
57
Agentes de Riesgo
Bioseguridad
Se entiende por agente de riesgo biológico
cualquier microorganismo -incluyendo de los
genéticamente modificados- cultivo celular,
animal o planta o producto de estos, capaz de
producir cualquier tipo de infección, alergia o
toxicidad en humanos, animales u otros seres
vivos.
58
Agentes de Riesgo - Grupo I
Bioseguridad
Sin riesgo o bajo riesgo individual y
comunitario. Agentes bien identificados que se
sabe que no producen enfermedad en humanos sanos
y existe un potencial mínimo de peligro para el
personal del laboratorio y el ambiente. Bacillus
subtillis Naegleria gruberi virus de la hepatitis
canina infecciosa
59
Agentes de Riesgo - Grupo II
Bioseguridad
Riesgo individual moderado y bajo riesgo
comunitario. Agentes asociados con enfermedades
en humanos, especialmente por ingestión o
exposición percutánea o mucosa. Patógenos que
pueden producir enfermedad en humanos animales
pero es poco probable que sea un problema para
los trabajadores del laboratorio, la comunidad,
los animales o el ambiente. La exposición en el
laboratorio puede producir una enfermedad seria
pero existe tratamiento efectivo y las medidas
preventivas están disponibles, el riesgo de
dispersión de la enfermedad es limitado. Salmonel
la spp. Virus de la Hepatitis B Toxoplasma
spp. Bacillus anthracis Bordetella pertussis
60
Agentes de Riesgo - Grupo III
Bioseguridad
Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario.
Trabajo con animales infectados con agentes
exóticos que tienen riesgo de transmisión por
aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o
potencialmente letal. Patógenos que usualmente
causan serias enfermedades en animales y humanos
pero que comúnmente no se propagan de un
individuo infectado a otro. Las medidas
preventivas y de tratamiento efectivo están
disponibles. Brucella bortus Coxiella
burnetii Mycobacterium
61
Agentes de Riesgo - Grupo IV
Bioseguridad
Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con
agentes peligrosos que tienen alto riesgo de
amenazar la vida, transmitirse por vía aérea o
que se desconoce su riesgo de transmisión. Patógen
os que usualmente causas serian enfermedades en
los animales o los humanos y que pueden
transmitirse de un individuo de forma directa o
indirecta. Usualmente no están disponibles ni
medidas preventivas ni tratamiento
efectivo. Virus de Marburg Ebola Virus Junín
62
Gabinetes de seguridad biológicaClase I (Campana)
Bioseguridad
C. Filtro de Escape HEPA
B. Ventana
A. Apertura frontal
D. Pleno de Escape
63
Gabinetes de seguridad biológicaClase II (Flujo
Laminar)
Bioseguridad
A. Apertura Frontal B. Ventana C. Filtro de
Escape HEPA E. Pleno de Escape de Presión
Negativa F. Ventilador G. Filtro HEPA adicional
para enviar aire.
A. Apertura Frontal B. Ventana C. Filtro de
escape HEPA D. Pleno posterior E. Filtro HEPA
de Suministro F. Ventilador
64
Gabinetes de seguridad biológicaClase III (Flujo
Laminar)
Bioseguridad
A. Inserciones para guantes con aros circulares
para instalarles guantes del largo del brazo al
gabineteB. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA D.
Filtro HEPA de Suministro E. Caja para Autoclave
de Doble Extremo.
65
Transporte de material riesgoso
Bioseguridad