L

1

• Lisolement et la manipulation des gènes
• B. Quelques applications de l'ADN recombinant
• La synthèse des gènes et leur expression  la
  production de protéines recombinantes.
• Organismes transgéniques plantes.
• Thérapie génique.
• Détection des gènes responsable des maladies
  génétiques.
• Objectifs
• Connaître quelques applications de l'ADN
  recombinant.

2

• Expression de lhormone de croissance humaine,
  avec élimination de la séquence humaine de
  signalisation

3

• Production pharmaceutique de linsuline humaine

4

• Système d'expression en 2 étapes Amplification

5
(No Transcript)
6
Génétique inverse

• La génétique inverse se base sur la construction
  de mutants pour découvrir le phénotype d'un gène
  (génotype).
• Génétique Génétique
  inverse
• phénotype mutant séquence d'une
  protéine
• allèle mutant séquence
  d'ADN
• séquence d'ADN allèle
  mutant
• séquence de la protéine phénotype
  mutant?

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Organismes transgéniques

• Modification du génome d'une espèce par
  l'introduction d'ADN extrinsèque
• De la même espèce ou d'une espèce différente
• Méthodes d'introduction
• 1- transformation
• 2- injection
• 3- virus
• 4- bombardement

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Destruction d'un gène

• Intégration
• homologue (même locus) ou
• hétérologue (locus différent)

9

• 2) Enlever des gènes
• Problème Les tomates mûres sont trop fragiles
  pour être transportées
• Solution habituelle
• 1) Cueillies vertes et transportées dans des
  camions réfrigérés
• 2) Exposées au gaz éthylique avant d'être envoyé
  aux magasins
• A) Stimule la synthèse de carotène (couleur)
• B) Stimule la synthèse de sucres (goût)
• C) Stimule la dégradation de la pectine dans les
  parois des cellules (amollissement)

10

• Solution génétique  Production de tomates qui
  restent fermes lorsqu'elles mûrissent
• En inhibant la production de l'enzyme
  polygalacturonase (PG) qui catalyse la
  solubilisation de la pectine
• En produisant de l'ARNm antisense qui sera
  complémentaire à lARNm du gène de lenzyme PG.
  Ceci entraîne une inhibition de la traduction.
• Nature 334 724-726 (1988)
• Plant Mol. Biol. 14 369-379

ARNm
Pas de traduction de lenzyme PG
Anti-ARNm
11

• Critiqué, parce que
• 1) La construction anti-PG est réalisé dans un
  plasmide qui contient un gène de résistance à un
  antibiotique.
• La résistance à cet antibiotique pourrait être
  transmise à des bactéries vivant dans le sol.
• Ce gène était nécessaire pour la sélection de
  cellules ayant la construction anti-PG.
• 2) L'insertion de ces gènes dans le chromosome
  des tomates pourrait aussi causer une mutation
  par intégration dans le génome.

12
Trois types de thérapie génique
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Thérapie somatique

• Les virus seront les vecteurs portant un allèle
  sain du géne deficient dans une maladie donnée
• A) Rétrovirus désarmé
• Intégration aléatoire (possibilité de muter un
  gène utile).
• N'affectent que les cellules en cours de
  prolifération (sanguines).
• Utilisé dans la SCID (enfants-Bulles)
• B) Adénovirus
• Ne s'intègre pas dans le génome (pas
  d'inactivation par insertion)
• Infecte aussi les cellules en état de
  non-prolifération
• Limité aux cellules épithéliales du système
  respiratoire
• Mucoviscidose gène CFTR

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Détection des gènes responsables des maladies
génétiques Diagnostic
15
(No Transcript)
16
Techniques classiques de détection

• 1) Détection de modifications physiologiques
• Ex. Phénylcétonurie gt accumulation de
  phénylalanine
• 2) Détection de présence ou absence d'activités
  enzymatiques
• Ex. Galactosémie gt pas de galactose 1-puridyl
  transférase
• Problème ne permet pas de détecter les maladies
  qui ne s'accompagnent pas de ces modifications
• Ex. Ne permet pas de détecter la dystrophie de
  Duchenne
• Solution cloner le gène et établir quels allèles
  sont présents
• 1) sites de restriction dans la séquence codante
• 2) sites de restriction près de la séquence
  codante
• 3) sonder avec des oligonucléotides
• 4) séquençage

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Sites de restriction dans la séquence codante

• Gène fonctionnel A 999 bases 333 acides
  aminés
• Gène non-fonctionnel a 996 bases 332 acides
  aminés
• lys glu gly phé
• fonctionnel ... AAA GAA GGC TTC ...
• non-fonc. ... AAA GAA --- TTC ...
• base 661 Eco RI

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• Après une digestion avec Eco RI
• 1) homozygote pour le gène fonctionnel (AA)
• Un fragment d'ADN de 999 bases
• 2) homozygote pour le gène non-fonctionnel (aa)
• Un fragment d'ADN de 666 bases et
• Un fragment d'ADN de 330 bases et
• 3) hétérozygote (Aa)
• Un fragment d'ADN de 999 bases et
• Un fragment d'ADN de 666 bases et
• Un fragment d'ADN de 330 bases

1 2 3
19
Anémie falciforme

• Maladie Disparition dun site de restriction
  dans la séquence codante du gène de beta-globine.

AS 1.3 1.1 0.2