Teste de Activa

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Teste de Activação de Basófilos por Citometria de
Fluxo

• Aplicação presentes e futuras na Alergologia

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Introdução

• O diagnostico das reacções alérgicas na prática
  medicinal resulta tanto do historial clínico como
  de testes e demonstrações a imunoglobulinas E
  específicas do soro e dos tecidos do indivíduo.
• BAT

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Princípios

• Basófilos são granulócitos que representam menos
  de 1 dos leucócitos.
• A activação do basófilo pode seguir dois caminhos
  principais a degranulação anafilática (AND) e a
  degranulação fragmentada (PMD), caracterizada por
  alterações morfológicas e secreção do conteúdo do
  grânulo sem exocitose.
• Marcadores principais FceRI, CD36,CD203c, P38
  MAPK

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Colheita e Preservação

• Uso até 3H após a recolha, tubo sem endotoxinas,
  anticoagulante EDTA ou heparina e temperatura
  ambiente
• Uso ate 24H após a recolha, anticoagulante EDTA e
  temperatura 4ºC

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Sangue Total ou Basófilos Isolados

• É simples isolar os leucócitos do sangue total,
  utilizando técnicas de centrifugação e de
  gradientes de densidade.

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Condições de Estimulação

• Após a estimulação, os basófilos reagem
  imediatamente, se as condições se encontrarem
  ideais.
• O pré-aquecimento de sangue, bem como o contacto
  com os reagentes por 15 min a 37ºC melhora
  significativamente a latência e magnitude de
  anti-IgE mediada por CD63.

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Marcação com IL-3

• Alguns autores têm mostrado que uma curta
  pré-incubação com IL-3 pode aumentar a
  sensibilidade dos ensaios baseados em CD63, mas
  esta medida não parece ser crucial para os
  potentes alérgenos proteicos e de estimulação com
  soro de pacientes com urticária auto-imune.

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Estimulação do Controlo Positivo e Negativo

• Para que haja uma interpretação correcta da BAT é
  necessário ter em conta a influência dos
  estímulos positivo e negativo.
• Tradicionalmente, o controlo positivo é um
  anticorpo policlonal ou monoclonal anti-IgE.
• Na ausência de estimulação controle positivo,
  torna-se impossível interpretar correctamente os
  resultados negativos das reacções alérgicas.

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Estimulação do Alergénio

• A análise de fluxo assistida e quantificação in
  vitro de basófilos activados geralmente depende
  da utilização de extractos de alérgenos naturais.

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Experiência de dosagem

• As respostas dos basófilos podem ser extremamente
  heterogéneas entre diferentes indivíduos.
• No entanto, a fosforilação de alérgenos
  específicos de p38 MAPK, de CD63 eCD203c
  geralmente não é restrita a um único estímulo,
  mas implica diferentes concentrações de
  estimulação que se estendem por várias escalas.

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Marcadores de Identificação

• Na maioria dos estudos correntes foi aplicado um
  anticorpo anti-IgE na amostra de sangue
  periférico com o objectivo de identificar os
  basófilos.
• Como outras células do sangue podem ser
  apresentar este anticorpo, para o estudo de
  citometria de fluxo a amostra deve contem
  CD203c, uma vez que a expressão desta é exclusiva
  da superfície dos basófilos.

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Marcadores de Activação

• No presente, os marcadores de activação mais
  utilizados são CD63 e CD203c.

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Análise de Basófilos do Paciente

• Actualmente, a análise de fluxo assistida e
  quantificação de basófilos activados in vitro
  mostrou-se sensível e específica para o
  diagnóstico de várias alergias mediadas por IgE,
  incluindo os clássicos alérgenos inalantes
  (ácaros, epitélio do gato, e pólen), alergia ao
  veneno de hymenoptera, alergia natural ao látex
  de borracha, alergias primárias e secundárias a
  alimentos e medicamentos.

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Análise de Basófilos de dadores atópicos

• A análise de fluxo assistida e quantificação de
  basófilos in vitro activados também pode ser
  aplicada em células obtidas de indivíduos atópicos

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Aplicações da Pesquisa

• A citometria de fluxo pode fornecer resultados
  referentes à dose de respostas e cinética de
  fosforilação de p38 MAPKqualitativamente
  similares aos dados obtidos com a técnica
  Wesern-blot.
• A citometria de fluxo oferece diferentes
  oportunidades que a tornam maisadequado para
  aplicação clínica.

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Conclusão, perspectivas, pontos de vista
especulativos

• JOANA VINES, CIÈNCIA VIVA, FACULDADE DE CIÈNCIAS
  MÉDICAS DE LISBOA