Fra i vari parametri che caratterizzano un amplificatore, alcuni sono di fondamentale importanza.

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AMPLIFICATORI

• Fra i vari parametri che caratterizzano un
  amplificatore, alcuni sono di fondamentale
  importanza.
• Il guadagno può variare fra l'unità ed alcune
  decine di migliaia di volte ed è espresso come il
  rapporto fra le intensità dei segnali di uscita e
  di ingresso. Esso va adeguato all'ampiezza del
  segnale biologico in ingresso in modo che possa
  pilotare efficacemente la successiva
  strumentazione (oscilloscopi, registratori a
  carta, registratori magnetici, convertitori A/D).
  Va però evitata una eccessiva amplificazione che
  potrebbe portare alla saturazione di qualche
  stadio dell'amplificatore con conseguente
  distorsione del segnale.
• L impedenza di ingresso può variare fra poche
  centinaia di kohm (105 ohm) fino a 1012, 1014
  ohm in amplificatori speciali (elettrometrici).
  Essa deve essere sempre diversi ordini di
  grandezza più elevata della resistenza
  complessiva del preparato e dell'elettrodo
  infatti queste due resistenze formano un
  partitore di tensione con la resistenza di
  ingresso dell'amplificatore determinando una
  attenuazione del segnale biologico.

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Divisore o partitore di tensione (voltage divider)



La tensione di uscita sarà sempre inferiore o al
massimo uguale ( R
0 )

1
a quella di ingresso.





quindi


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• AMPLIFICATORE DIFFERENZIALE
• E' un amplificatore molto utilizzato in vari
  campi della elettrofisiologia per le sue
  particolari caratteristiche.
• Esso presenta due ingressi, uno chiamato
  invertente (-) ed uno non invertente ().
• La sua caratteristica fondamentale è quella di
  amplificare sempre la differenza fra i segnali
  presenti ai due ingressi. Teoricamente quindi, se
  ai due ingressi è presente lo stesso segnale
  (segnale di modo comune), anche di ampiezza
  elevata, all'uscita dell'amplificatore il segnale
  amplificato è nullo.
• In pratica un amplificatore differenziale reale è
  tanto migliore quanto più si avvicina a quello
  teorico.

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LE DERIVAZIONI INTRACELLULARI

• Le derivazioni intracellulari consentono la
  misura del potenziale di membrana e del
  potenziale dazione.
• Consentono anche di iniettare corrente nella
  cellula e di studiare le proprietà eccitabili
  della membrana.
• Vengono utilizzati microelettrodi con la punta
  molto fine (inferiore al µm) e riempiti, salvo
  casi particolari, con KCl 3M.
• Gli ingressi degli amplificatori debbono
  possedere una elevatissima resistenza in ingresso
  (solitamente gt 1010 ohm) ed una bassa capacità,
  dal momento che i microelettrodi presentano
  normalmente resistenze dellordine di 20 50
  Mohm.
• Il guadagno degli amplificatori non è di solito
  molto elevato (10 100 volte).
• Gli amplificatori presentano anche, oltre a
  circuiti per la compensazione dei potenziali di
  contatto e giunzione, circuiti per la
  compensazione della capacità in ingresso.

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Iniezione di corrente (current clamp)
Il metodo tradizionale per la derivazione dei
potenziali intracellulari è basato su uno stadio
in ingresso voltage follower accompagnato da un
sistema di iniezione di corrente current clamp
Se un sistema di iniezione di corrente (sorgente
di corrente costante) è applicato al nodo di
ingresso dellamplificatore (vedi figura), tutta
la corrente iniettata fluisce attraverso il
microelettrodo allinterno della cellula. In
questo modo si possono iniettare impulsi di
corrente per stimolare la cellula o correnti
costanti per depolarizzarla o iperpolarizzarla,
come pure forme donda variabili per particolari
esigenze.
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Esempio di derivazione intracellulare

• Derivazioni da singole fibre in risposta a
  stimolo meccanico (labirinto)
• Gli inserti mostrano, in maniera amplificata,
  gli EPSP i potenziali dazione sono troncati.

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Esempio di current clamp

• Iniezione in un neurone (ganglio umano) di vari
  livelli di corrente iperpolarizzante e
  depolarizzante.
• Lartefatto di stimolazione è stato annullato
  con la compensazione a ponte.

Col metodo del current clamp si fa passare
attraverso la membrana una corrente di intensità
nota e si registrano le variazioni di potenziale
che ne risultano, con linconveniente che il
comportamento dei canali voltaggio- e
tempo-dipendenti non può essere studiato
adeguatamente, perché le correnti ioniche
(voltaggio-dipendenti) e capacitive si
influenzano reciprocamente.
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"VOLTAGE CLAMP" A DUE ELETTRODI

• Il Voltage clamp consente di bloccare il
  potenziale di membrana al valore desiderato,
  misurando la corrente necessaria per
  stabilizzare la condizione.
• Il potenziale di membrana (Vm) è misurato da un
  amplificatore (A1) connesso al microelettrodo di
  potenziale (ME1).
• Vm è confrontato con il potenziale di comando
  (Vcmd) in un amplificatore differenziale ad alto
  guadagno (A2 guadagnoG).
• L'uscita di A2 è proporzionale alla differenza
  fra Vm e Vcmd. Il voltaggio all'uscita di A2
  inietta corrente nella cellula attraverso il
  microelettrodo di corrente (ME2).
• Nella realtà l'applicazione del voltaggio non
  avviene istantaneamente, ma necessita un tempo
  finito per caricare, da parte della corrente, la
  capacità della cellula.
• La costante di tempo t per i transienti di
  corrente e di potenziale è
•  t Rp2Cm/µ
• dove Rp2 è la resistenza del microelettrodo ME2,
  Cm la capacità di membrana e m il guadagno.

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Voltage clamp
Col metodo del voltage clamp la membrana viene
portata ad un potenziale fisso prestabilito e si
registrano le correnti necessarie a mantenere la
membrana bloccata (clampata) a quel
potenziale.
Un amplificatore differenziale (A) inietta nella
cellula una corrente Im, proporzionale alla
differenza tra un potenziale di comando
(applicato allingresso ) ed il potenziale di
membrana Vm (applicato allingresso -) .

• Si ottengono così due risultati utili
• Vm viene quasi portato a coincidere col
  potenziale di comando
• la variazione di Vm è praticamente istantanea,
  cosicché la corrente capacitiva (IcC dV/dt),
  anche se molto intensa, dura per un tempo
  brevissimo.
• Da quel momento in poi verrà registrata (ad un
  potenziale prestabilito, che viene mantenuto
  costante) solo la corrente ionica

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Prendiamo in esame i risultati di un tipico
esperimento di voltage clamp.
Iniziamo con il potenziale di membrana fissato al
suo valore di riposo. Se ora imponiamo alla
membrana una depolarizzazione di 10 mV,
osserviamo, all'inizio, una brevissima corrente
capacitiva uscente (Ic), che carica
istantaneamente la capacità della membrana nella
misura richiesta da una depolarizzazione di 10 mV.
Tale corrente è seguita da una corrente ionica
uscente (Ii), di intensità minore, che persiste
per tutta la durata dell'impulso depolarizzante.
Ritornando alle condizioni iniziali, si osserva
una breve corrente capacitiva entrante (scarica
del condensatore di membrana) mentre la corrente
ionica si annulla.
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La corrente ionica costante evocata dalla piccola
depolarizzazione di 10 mV è detta corrente di
fondo (o di leakage Il ) ed è una corrente
ohmica. I canali che sostengono questa corrente
sono sempre aperti e sono i principali
responsabili della genesi del potenziale di
membrana a riposo. In generale, nelle cellule
nervose, la maggior parte dei canali di fondo
sono permeabili agli ioni K, mentre altri sono
permeabili agli ioni CI- e Na.
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Se si effettuano depolarizzazioni di entità
maggiore, i tracciati delle correnti divengono
assai più complessi. Anzitutto sia le correnti
capacitive che quella di fondo (tratteggiata in
B) hanno intensità proporzionalmente maggiore.
Inoltre, immediatamente dopo l'esaurimento delle
correnti capacitive e l'inizio di quelle di
fondo, si osserva una corrente entrante che
raggiunge il suo valore massimo entro pochi
millisecondi,
poi si riduce di ampiezza e viene sostituita da
una corrente uscente. La corrente uscente
raggiunge un plateau che viene poi mantenuto per
tutta la durata della depolarizzazione.
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Voltage-clamp sullassone gigante di
calamaro come eseguito da Hodgkin e Huxley
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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APPROFONDIMENTO Il metodo fondamentale che
permette di identificare quali ioni conducono una
determinata corrente è basato sull'uso della
equazione di Nernst. Per esempio, se il
potenziale di membrana è mantenuto uguale al
potenziale di equilibrio del sodio, ENa, la forza
dovuta al gradiente elettrochimico del sodio sarà
uguale a zero e la corrente sodio dovrebbe
estinguersi. A potenziali più negativi di ENa,
INa dovrebbe essere entrante, e a potenziali più
positivi di ENa dovrebbe essere uscente. Perciò
in una serie di esperimenti si può cambiare in
modo sistematico il potenziale di membrana per
trovare il potenziale di inversione della
risposta ovvero il potenziale a cui la corrente
si inverte da entrante ad uscente. In realtà
questo approccio non è praticabile nel caso del
canale del Na voltaggio-dipendente che inattiva
in depolarizzazione. Perciò attenzione a come
viene condotto lesperimento nel caso del canale
del Na voltaggio-dipendente, che inattiva in
depolarizzazione.
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La tecnica del patch clamp
Era noto da lungo tempo che attraverso la
membrana plasmatica è possibile un rapido scambio
di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann a cavallo tra
gli anni 70 e 80 furono i primi a mostrare
lesistenza di canali ionici specifici
Erwin Neher Bert Sakmann Premi Nobel per la
medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica
del patch-clamp rendendo possibile la
caratterizzazione di singoli canali ionici
27
La tecnica del PATCH CLAMP
L "idea di base del PATCH CLAMP fu sviluppata da
Neher e Sakmann tra il 1976 e il 1981. Il
principio è riassunto nella figura seguente.

• Impiega un solo microelettrodo in intimo
  contatto con la membrana cellulare
• Lo stesso elettrodo è impiegato sia per variare
  il potenziale che per misurare direttamente la
  corrente della membrana.
• E possibile caratterizzare, a secondo della
  configurazione usata, sia i canali ionici
  sottostanti lorifizio dellelettrodo, che quelli
  presenti in una parte o in tutta la membrana

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Il setup per il patch-clamp
computer
oscilloscopio
amplificatore
29
La configurazione di cell-attached
30
Registrazione di una corrente elettrica che
fluisce attraverso un singolo canale ionico
Elettrodo di registrazione micropipetta di vetro
? 10-6 m
Resistenza della saldatura gt1 GW
Con un opportuno equipaggiamento elettronico e
opportune condizioni sperimentali è possibile
misurare questa corrente microscopica
Quando un singolo canale si apre, gli ioni si
muoveranno attraverso il canale come una corrente
elettrica
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Formazione del Gigaseal Rs 109 1010 ohm
Rsresistenza del seal Rpresist. della
pipetta Rinresist. dingresso Vppotenziale
della pipetta
Correnti di membrana dovute ad un singolo canale
aperto o chiuso. A membrana elettricamente
eccitabile B Membrana chimicamente
eccitabile
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Una registrazione da patch richiede una forte
saldatura tra pipetta e membrana
la qualità della misura dipende da quanto si
riesce a minimizzare le perturbazioni della
cellula. Nel caso di una registrazione di
potenziale tale aspetto può essere rappresentato
in questo modo.
infatti IEK/(RKRS) IV/RS V/RSEK/(RKRS)
? VEKRS/(RKRS)
Lelettrodo sta misurando il potenziale di riposo
di una cellula la cui membrana contiene solo
canali del K aperti. Allaumentare della
resistenza di seal Rs, la misura si avvicina
sempre di più al valore di EK
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Seals buoni e cattivi
Nel caso di una registrazione da patch, le
correnti attraverso la saldatura (seal) non
distorcono il voltaggio o la corrente misurati,
ma si sommano al rumore della corrente.
In una registrazione da patch (cell-attached,
inside- o outside-out), anche la corrente
attraverso il seal fluisce lungo il circuito di
misurazione, aumentando il rumore sulla corrente
misurata.
Ad es., se la corrente attraverso il seal è dieci
volte più ampia di quella attraverso il canale,
allora le fluttuazioni statistiche nel flusso di
corrente prodotta dal seal sono v10 (316) più
ampie di quanto sarebbero in un seal perfetto.
34

• La pipetta di vetro in questo caso ha una punta
  più grande di un elettrodo tradizionale, perchè
  non deve bucare la membrana plasmatica. Ha un
  diametro interno di 0.5-2 µm ed è più o meno
  arrotondata. E' inserita in un portaelettrodo a
  tenuta, a sua volta collegato con un tubicino ad
  una fonte di suzione.
• Viene avvicinata alla cellula, ed a questo punto
  viene applicata una leggera pressione negativa
  se tutto va bene, cellula ed elettrodo aderiscono
  saldamente.
• Non si ottiene solo un'adesione stabile
  meccanicamente (se la cellula è isolata e non
  aderisce al fondo della vaschetta è possibile
  sollevarla e spostarla a piacere), ma anche un
  sigillo ad altissima resistenza elettrica (Rs)
  (da 1 a centinaia di Gohm - 109 ohm), cioè tale
  da presentare una elevata resistenza al passaggio
  di corrente fuori dalla zona di contatto fra
  elettrodo (riempito anche qui di soluzione
  conduttrice) e membrana.
• In queste condizioni, se nell'area di membrana
  sottesa all'elettrodo, dell'ordine di pochi µm2,
  ci sono dei canali ionici, la corrente che
  fluisce attraverso di essi quando sono nella
  conformazione "aperta" passerà attraverso
  l'elettrodo, senza disperdersi nello spazio
  esterno, e potrà essere rilevata da un sistema di
  amplificazione che abbia un rumore intrinseco
  sufficientemente basso (le correnti di singolo
  canale sono dell'ordine di 0.1-50 pA).
• Questa configurazione, chiamata CELL ATTACHED
  PATCH, è quella di base, da cui si parte per
  tutte le successive modificazioni e applicazioni
  della tecnica. Essa consente quindi di effettuare
  registrazioni di singolo canale ( figura
  seguente) in condizioni in cui la cellula è
  intatta, il suo mezzo intracellulare
  imperturbato, in condizioni quindi il più libere
  possibile da artefatti sperimentali. Si lavora in
  VOLTAGE CLAMP, in quanto il voltaggio della
  pipetta è mantenuto ad un valore costante e che
  può essere variato a piacere con il potenziale di
  comando in condizioni opportune è possibile
  misurare l'ampiezza della corrente in funzione
  del voltaggio applicato e ricavare informazioni
  sulla conduttanza di singolo canale.

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• Inconvenienti della configurazione di
  cell-attached patch
• Il principale inconveniente è che il potenziale
  di membrana (Vm) della cellula è sconosciuto,
  perchè nessun contatto con l'ambiente interno è
  stato realizzato, per cui è ignoto il valore
  della ddp (Vc-Vm) presente ai capi del singolo
  canale di cui si misura la corrente. Per
  ricavarlo bisogna introdurre un elettrodo
  tradizionale (ma così si complicano di nuovo le
  cose), oppure distruggere il patch e passare alla
  configurazione WHOLE CELL (vedi sotto) a volte,
  più semplicemente, si prende un valor medio di Vm
  ottenuto con misurazioni separate, con tutti i
  limiti di una simile assunzione.

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Sommando un gran numero di registrazioni di SCC
sincronizzate, otterremo levoluzione temporale
della corrente macroscopica
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Micropipetta Apertura 0.5-1 mm Bassa
resistenza Saldatura (50 MW)
Differenti tipi diPatch
Corrente di leakage
Membrana cellulare
Corrente di membrana

• Whole-cell patch clamp
• Simile alla tecnica di derivazione
  intracellulare.
• Una bassa resistenza di accesso produce
  registrazioni a basso rumore.
• Molti canali contribuiscono al segnale.
• Un certo tipo di canali viene isolato con
  protocolli di voltaggio e farmaci.
• Outside-out patch clamp
• Usato per valutare la risposta di singoli canali
  al voltaggio e a sostanze extracellulari
  (neurotrasmettitori ecc.).
• Inside out patch clamp
• Usato per valutare la risposta di singoli canali
  al voltaggio e a sostanze intracellulari (secondi
  messaggeri ecc.).

Suzione
Gigaseal (gt1 GW)
Una breve suzione rompe il patch di membrana
Il ponte citoplasmatico collassa
Trazione
Trazione in un mezzo a basso Ca2
Trazione
Il ponte citoplasmatico collassa
Lesposizione allaria rompe la vescicola
Resistenza dellelettrodo 2-10 MW
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Configurazione di WHOLE-CELL
Finora ci siamo riferiti alla condizione chiamata
cell attached (A). Questa è necessaria per la
registrazione delle correnti di singolo canale,
ma non è lunica configurazione della tecnica
del patch clamp.
La condizione di whole cell (B) è quella più
usata. Essa permette di registrare le correnti
ioniche che attraversano tutta la membrana,
effettuando un voltage clamp con un solo
elettrodo anzichè due elettrodi
Naturalmente la soluzione che riempie lelettrodo
devessere tale da perturbare il meno possibile
la composizione ionica intracellulare.
Che caratteristiche dovrà avere in linea di
massima ?
Però le proteine intracellulari (protein-chinasi,
calmoduline ecc.) vengono inevitabilmente
dilavate.. Per aggirare questo problema, si può
usare le tecnica del perforated patch, che
consiste nel restare in cell-attached
aggiungendo nellelettrodo delle molecole che
formano canali ionici non selettivi, ad es. la
Nistatina
39
Configurazione di whole cell patch-clamp
E' l'applicazione della tecnica del PATCH CLAMP
utilizzata per ottenere i risultati di un VOLTAGE
CLAMP tradizionale. Sempre partendo dalla
configurazione CELL ATTACHED, con un 'ulteriore
suzione si può rompere il patch di membrana, e
stabilire così un accesso diretto fra
microelettrodo e citoplasma (vedi figura), senza,
se tutto va bene, peggiorare la qualità del
sigillo.
40

• L'accesso è migliore di quello che si può
  realizzare perforando la membrana plasmatica con
  un microelettrodo tradizionale, in quanto la
  resistenza della pipetta è minore, e la
  dispersione di corrente verso il mezzo esterno è
  minore, grazie al sigillo ad alta resistenza.
  Sempre a causa della bassa (massimo qualche Mohm)
  resistenza della pipetta (dovuta al suo diametro
  relativamente grande), il potenziale a cui è
  mantenuto l'elettrodo dal sistema elettronico di
  amplificazione e controllo può essere considerato
  in prima approssimazione lo stesso della cellula,
  e le correnti che fluiscono attraverso tutta la
  membrana cellulare possono essere registrate
  dall' elettrodo.
• Si possono così effettuare registrazioni di
  correnti totali in condizioni di VOLTAGE CLAMP
  utilizzando un solo elettrodo.
• Tutto questo è in realtà vero se forma e
  dimensioni della cellula sono adeguate se no, il
  sistema non permette un mantenimento della
  costanza del potenziale in tutta l'estensione
  della cellula, cioè un vero VOLTAGE CLAMP.
• Un importante aspetto di questa configurazione è
  che, dato il grande diametro della via di accesso
  fra elettrodo e cellula, e dato che il volume
  dell'elettrodo è infinitamente più grande di
  quello della cellula, ci sarà un mescolamento fra
  i contenuti dei due scomparti, ed in sostanza
  l'ambiente citosolico si porterà in equilibrio
  con i soluti contenuti nell'elettrodo. Questo può
  essere importante in alcuni casi, in cui si
  vogliano effettuare registrazioni con un ambiente
  controllato sulle due facce della membrana, ma
  comporta l'inconveniente che componenti
  citosolici importanti per la risposta che si
  vuole studiare (enzimi, messaggeri interni)
  possono essere lavati via, diluiti.
• D'altra parte, se la cellula è di grosse
  dimensioni e/o di forma molto lontana da quella
  sferica, può essere molto difficile non solo
  ottenere un buon VOLTAGE CLAMP, ma anche una
  buona perfusione intracellulare.

41
LE ALTRE CONFIGURAZIONI DEL PATCH-CLAMP Dalla
configurazione di cell-attached, con alcune
manovre sperimentali, se ne possono ottenere
delle altre, oltre a quella del whole-cell
patch - L'INSIDE OUT PATCH Se si ritrae
l'elettrodo, è possibile, se il sigillo è molto
buono, che il patch si stacchi insieme
all'elettrodo. Si ha così (figura pagina
seguente) un frammento di membrana, con uno o più
canali ionici, sotteso all'orifizio dell'
elettrodo, con la faccia citoplasmatica rivolta
verso la soluzione presente nella vaschetta
questa soluzione può essere rapidamente e
ripetutamente cambiata, e si può così studiare,
ad esempio, il ruolo di messaggeri intracellulari
nella regolazione delle proprietà dei canali
ionici. Lo svantaggio è che, separando il canale
dall'ambiente citoplasmatico, può andare perso un
qualche fattore indispensabile per l'apertura del
canale stesso, e difficilmente identificabile. -
L'OUTSIDE OUT PATCH Quest'ultima configurazione
può essere ottenuta ritraendo l'elettrodo dalla
cellula dopo che si è realizzata la
configurazione WHOLE CELL. Si forma un ponte
citoplasmatico che può, spezzandosi, lasciare
attaccato all'elettrodo un frammento di membrana
plasmatica con la faccia esterna rivolta verso il
contenuto della vaschetta, e quella
citoplasmatica verso l'interno dell'elettrodo. Si
possono così effettuare registrazioni di singolo
canale, con l'opportunità in questo caso di
cambiare facilmente la composizione del mezzo
presente sulla faccia esterna della membrana, e
studiare gli effetti di sostanze (agonisti,
bloccanti) che possono influenzare le proprietà
dei canali presenti in quel patch.
42
Configurazione di OUTSIDE-OUT
Dalla configurazione whole cell si può
facilmente passare alla configurazione di
outside out, nella quale il patch presenta
allesterno dellelettrodo il versante
extracellulare della membrana.
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Configurazione di OUTSIDE-OUT
Loutside-out è molto utile per studiare le
correnti di singolo canale date dai
recettori-canale, come ad esempio il recettore
nicotinico per lacetilcolina
44
Configurazione di INSIDE-OUT
La quarta config. è l inside out (B), nella
quale il patch presenta allesterno
dellelettrodo il versante intracellulare della
membrana.
La sua principale applicazione è nello studio dei
canali chemio-dipendenti attivati per via
indiretta dal versante intracellulare, facendo
arrivare sul patch ad es. proteine-G, o secondi
messaggeri, o protein-chinasi, ecc. . Più avanti
vedremo come questa configurazione sia stata
fondamentale nello studio dei canali GIRK
45
(No Transcript)
46
Alcune considerazioni generali sul patch clamp

• In tutti i quattro casi descritti sopra si
  parte, comunque, dalla formazione di un sigillo
  fra pipetta e membrana. Perchè questo possa
  avvenire è necessario che sia l'elettrodo che il
  mezzo in cui è tenuto il preparato siano il più
  puliti possibile, ma anche, che la membrana
  plasmatica della cellula da cui si vuole
  registrare non presenti detriti o sostanze che
  possano ostacolare il contatto col vetro della
  micropipetta. Per ridurre questi problemi è
  consigliato filtrare il mezzo dell'elettrodo
  subito prima del riempimento e di avvicinarsi
  alla cellula applicando una lieve pressione
  positiva che allontana eventuali frammenti dalla
  punta dell'elettrodo.
• Si può più facilmente realizzare una situazione
  di cellule pulite effettuando un leggero
  trattamento enzimatico, o utilizzando cellule
  isolate, dissociate enzimaticamente o in coltura.
  Ed è proprio lo sviluppo, soprattutto a partire
  dagli anni '70, delle tecniche di preparazione di
  colture cellulari che ha consentito la grande e
  rapida diffusione del PATCH CLAMP. Un successivo
  sviluppo, che ha avuto un impatto notevole in
  neurobiologia, è legato alla possibilità di
  lavorare su fettine di SN è stato così
  possibile effettuare registrazioni da cellule che
  conservano, almeno in parte, le loro normali
  relazioni funzionali.
• Nonostante la tecnica sia stata sviluppata
  all'inizio soprattutto per poter registrare gli
  eventi di singolo canale, la configurazione più
  utilizzata è sicuramente quella di WHOLE CELL.
  Questo sviluppo, in parte imprevisto, è
  attribuibile a vari fattori.

47

• Innanzitutto, le misure di singolo canale, molto
  importanti per determinare in maniera diretta le
  proprietà molecolari dei canali (cinetiche,
  meccanismi di blocco, ecc.) hanno senso compiuto
  solo se vengono utilizzate su preparati di cui
  siano note le proprietà elettrofisiologiche
  macroscopiche. Nel caso di molti tipi cellulari
  le cui proprietà sono state studiate solo
  nell'ultimo decennio, questo ha voluto dire fare
  prima (o comunque anche) gli esperimenti di WHOLE
  CELL.
• Grazie a questa tecnica è stato possibile
  studiare le proprietà elettrofisiologiche di
  piccoli neuroni, cellule ghiandolari, cellule
  muscolari lisce e cardiociti, fibroblasti,
  cellule epiteliali e linfociti, tutte cellule che
  era molto difficile studiare con le tecniche di
  VOLTAGE CLAMP tradizionali. Grazie a questi dieci
  e più anni di nuova elettrofisiologia, oltre che
  alle nuove tecniche di biologia cellulare e
  molecolare, è scaturito un panorama molto più
  vario e complesso della natura e del ruolo degli
  eventi elettrici a livello cellulare. Se la nuova
  tecnica ha consentito di allargare la nostra
  visione al di là dei preparati "classici", nervo
  e muscolo, ha avuto anche un impatto profondo
  sulla neurofisiologia la possibilità di
  registrare dalle arborizzazioni dendritiche e dai
  terminali pre- e postsinaptici ha fatto sì che la
  concezione della cellula nervosa come semplice
  relè cedesse il posto ad una visione più
  complessa ed articolata, e che si potessero
  gettare le basi, a livello cellulare, della
  comprensione di fenomeni fondamentali come la
  memoria.

48
Ulteriori sviluppi ed applicazioni.

• In questi anni ci sono stati importanti sviluppi
  tecnici in varie direzioni (a parte l'uso delle
  fettine di SN cui abbiamo già accennato), per
  allargare le potenzialità della tecnica e cercare
  di superare alcuni suoi inconvenienti.
• Uno dei problemi principali legati all'uso del
  WHOLE CELL PATCH CLAMP, è come abbiamo visto,
  legato alla perfusione interna della cellula da
  parte del contenuto dell' elettrodo questo
  problema è stato affrontato in due modi
  radicalmente diversi.
• Il primo approccio consiste nello sfruttare
  compiutamente questo fatto, realizzando un
  sistema che consenta di cambiare rapidamente la
  soluzione contenuta nell'elettrodo se la cellula
  non è troppo grande si può pensare che in tempi
  relativamente rapidi (decine di secondi) le
  variazioni si ripercuotano sulla composizione
  dell 'ambiente intracellulare.
• E' una tecnica abbastanza difficile da usare
  come routine, ma è stata impiegata da vari
  laboratori per studiare gli effetti di messaggeri
  intracellulari sulla regolazione delle correnti
  ioniche. Una recente variazione sul tema consiste
  nell'uso dei cosiddetti caged compounds, molecole
  o ioni legati ad un inibitore da cui possono
  .essere liberate per fotolisi con un flash di
  luce UV. Si mette il composto caged
  nell'elettrodo, si realizza la condizione di
  WHOLE CELL, si inizia la registrazione, e poi si
  libera per fotolisi la sostanza (calcio, IP3'
  ecc.), la cui concentrazione aumenta così
  istantaneamente, consentendo di osservare
  eventuali effetti rapidi sulle correnti.

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• Il secondo approccio punta ad evitare gli
  inconvenienti della diluizione dei componenti
  citosolici solubili questa modificazione della
  tecnica di base va sotto il nome di "perforated
  patch" o di "slow whole celI". Si tratta in
  sostanza di realizzare un CELL ATTACHED PATCH con
  un elettrodo riempito con una soluzione che
  contiene sostanze permeabilizzanti (ATP in alcuni
  casi, o più comunemente, nistatina o
  anfotericina, tutte molecole che formano pori
  ionici nelle membrane) le piccole molecole e gli
  elettroliti possono essere scambiati, mentre le
  macromolecole citosoliche non possono uscire
  dalla cellula. Si possono così effettuare
  registrazioni di eventi elettrici, anche in
  condizioni di VOLTAGE CLAMP, senza che la
  biochimica della cellula sia perturbata.
• Un altro tipo di misure che si può realizzare in
  condizioni di WHOLE CELL CLAMP è quello della
  capacità della membrana (con opportuni
  amplificatori) è stato così possibile, ad
  esempio, studiare in maniera quantitativa
  l'accoppiamento eccitamento- esocitosi in diversi
  preparati.
• Sono state infine effettuate registrazioni da
  strutture subcellulari isolate, come i
  mitocondri, la membrana nucleare, il reticolo
  endoplasmatico da frazioni cellulari (il "whole
  terminal" patch su terminali presinaptici il
  "perforated vescicle patch", che consiste nello
  staccare dalla cellula e trattenere nella
  pipetta, non un patch di membrana isolato, ma una
  vescicola contenente anche organelli
  subcellulari).

50
AMPLIFICATORI OPERAZIONALI

• Lamplificatore operazionale ideale (A.O.) è
  essenzialmente, un amplificatore di tensione,
  avente le seguenti caratteristiche
•         guadagno infinito
•         ingresso differenziale
•         impedenza di ingresso infinita e
  impedenza di uscita nulla.

51
LAO può essere definito funzionalmente come un
amplificatore differenziale, cioè un dispositivo
attivo a tre terminali che genera al terminale di
uscita una tensione proporzionale alla differenza
delle tensioni fornite ai due terminali di
ingresso.
Il segnale di uscita V0 è il risultato della
somma tra il segnale applicato allingresso
invertente, V1, invertito di segno e amplificato
di un fattore A-, con il segnale allingresso non
invertente, V2 , a sua volta amplificato di
fattore A.
52
Compensazione dei potenziali di giunzione

• Un notevole contributo ai potenziali misurati
  presenti alluscita dellamplificatore è dato
  dalla somma dei vari potenziali di giunzione o di
  diffusione.
• Questi sono generati ogniqualvolta metalli
  (elettrodi) sono in contatto con soluzioni
  ioniche oppure soluzioni con diverse
  concentrazioni sono in contatto fra loro (punta
  del microelettrodo.
• Si può eliminare la somma di tutti questi
  potenziali introducendo, per mezzo del comando
  offset dellamplificatore, un potenziale di segno
  opposto quando il microelettrodo si trova nel
  bagno esterno, prima di penetrare la cellula.