Lipid Rafts und Cavaeolae Vorlesung Zellbiologie Huber

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Lipid Rafts und CavaeolaeVorlesung Zellbiologie
Huber
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Plasma Membran Komposition

• Die Plasma Membran von Säugetierzellen enthält 4
  Hauptklassen von Phospholipiden
• Phosphatidylcholin
• Phosphatidylethanolamin
• Phosphatidylserin
• Sphingomyelin
• Zusammen mehr als die Hälfte aller Lipide in
  zellulären Membranen

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Phospholipide bestehen aus zwei langkettigen
Fettsäuren, die über eine Esterbindung an eine
kleine hydrophile Gruppe gebunden sind
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Phospholipids sind amphipathisch

• Deshalb aggregieren Phospholipide nicht in
  Tropfenform, sondern orientieren sich spontan zu
  Membranen, mit den hydrophilen Gruppen nach
  aussen, zur wässrigen Umgebung.
• Moleküle, die mit einem Ende mit der wässrigen
  Umgebung interagieren und mit dem anderen Ende
  hydrophob sind werden als amphipathisch
  bezeichnet (Griechisch, tolerant für beides).

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Plasma Membran Komposition

• Die Phospholipide sind asymmetrisch zwischen dem
  inneren und äußeren Bi-Layer angeordnet

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Glykolipide

• Zusätzlich zu den Phospholipiden enthalten
  Membranen von Säugetieren Glykolipide
• Diese Glykolipide findet man hauptsächlich im
  äußeren Leaflet des Bilayers, mit den
  Kohlenhydratresten an der Zelloberfläche.
• Sie stellen aber nur einen relative geringen
  Anteil aller Lipde dar (2)

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Struktur von Glykolipiden

• Zwei Kohlenwasserstoff Ketten vereinen sich zu
  einer polaren Kopfgruppe über ein Serin mit einem
  Kohlenhydratrest (zB Zucker)

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Cholesterin

• Zusätzlich enthalten Zellmembranen von Säugern
  Cholesterin.
• Cholesterin, ist ein Hauptbestandteil zellulärer
  Mmebranen und damit in gleichen molaren Mengen
  wie Pospholipide vertreten.
• Aber Cholesterin kann nicht spontan Membranen
  bilden!

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Cholesterin im Bilayer

• Die Cholesterinmoleküle orientieren sich im
  Bilayer mit ihren Hydroxylgruppen in die
  unmittelbare Nachbarschaft zu den polaren
  Kopfgruppen der Phospholipidmoleküle.
• Die starre, plattenförmige Steroidstruktur
  interagiert und stabilisiert dadurch teilweise
  jene Abschnitte der Kohlenwasserstoff-ketten, die
  am nächsten zu den polaren Kopfgruppen liegen.

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Lipid-Zusammensetzung von Membranen
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Cholesterin und Mikroviskosität

• Einflüsse von Cholesterin auf die Viskosität der
  Membran sind Temperaturabhängig.
• Bei höheren Temperaturen, kann Cholesterin die
  freie Beweglichkeit der Fettsäurenketten der
  Phospholipide behindern und somit den äußeren
  Bilayer steifer/rigider machen.
• Dadurch verändert sich auch die
  Zellmembran-Permeabilität für kleine Moleküle.
• Jedoch bei niedrigen Temperaturen hat Cholesterin
  den gegenteiligen Effekt Durch die Interaktion
  mit den Fettsäurenketten der Phospholipide, kann
  Cholesterin Membranen vorm Einfrieren bewahren
  und deren Beweglichkeit/Mikro-Viskosität
  bewahren.

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Das Fluid Mosaic Modell

• In Biomembranen sind nahezu alle Membranproteine
  lateral mobil und frei diffundierbar.
• ImFfluid Mosaic Modell, wird die Membran als
  zwei-dimensionales Mosaik dargestellt, das von
  Phospholipiden und Proteinen gebildet wird.

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Lipid Rafts sind Andock- und Interaktionsplattform
en für Proteine
raft
caveola
.... formed by dynamic clustering of
sphingolipids and cholesterol and move within
the fluid bilayer, e.g. during signal
transduction. From Simons and Ikonen, Nature
1997, 387 569-72
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• Sie entstehen und bestehen aus einem dynamischen
  Zusammenschluss von Cholesterin und
  Sphyngolipiden im äußeren Leaflet des Bilayers.
• Die gesättigten Kohlenwasserstoffketten der
  Sphyngolipide erlauben dem Cholesterin sich
  optimal in der äußeren Hälfte der Membran zu
  verankern.
• Das innere Leaflet enthält mehr Phospholipide
  mit gesättigten Fettsäuren und auch Cholesterin.

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Rafts bilden Caveaolae
Caveolae on the plasma membrane of a human
fibroblast. (A) Electron micrograph of a
fibroblast in cross-section showing caveolae as
deep indentations in the plasma membrane. (B)
Deep-etch electron micrograph showing numerous
caveolae at the cytoplasmic side of the plasma
membrane.
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• Caveoline
• 150 AS Membran Proteine
• Sind die Bausteine der Caveolae
• N- und C-Terminus ragen ins Zytoplasma vor
  integrales und nicht transmembran Protein
• Oligomerisieren
• Hydrophobes Ende steckt in der Membran
• Binden Cholesterin

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Funktionen von Caveolae

• Endozytose, Transzytose
• Signal Transduktion
• Cholesterin Transport
• Pathogen Eintritt in Zellen
• Potozytose
• Lipid-verankerte Membran Rezeptoren in Caveolae
  nehmen kleine Moleküle wie Vitamine und Lipide
  auf.

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Methoden zur Untersuchung von Raft-Strukturen?
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Biochemische Anreicherung / Reinigung von
Caveolae and Rafts

• Extraktion mit Triton-X 100 auf Eis
• Rafts and damit assoziierte Proteine werden
  dadurch unlöslich
• Flotation in Zucker / Optiprep Gradienten
• Das detergenz-unlösliche Material flotiert hoch,
  wegen des Lipidgehaltes.

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Flotation and Visualisierung von Rafts
Oliferenko et al., JCB 1999
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Methoden zur Untersuchung von Raft-Strukturen?
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Intracelluläres Annexin II wird von Innen an
antibody-crosslinked CD44 Microdomänen rekrutiert
Oliferenko et al., JCB 1999
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Keine Cluster wenn Cholesterin aus Membranen
depletiert wird
CD44
annexin II
merge
Oliferenko et al., JCB 1999
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(No Transcript)
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Immunogold und Freeze Fracture
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(No Transcript)
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Größere Lipid-Domänen können mittels Single
Molecule Microscopy dargestellt werden

• G.J. Schütz, G. Kada, V.Ph. Pastushenko and H.
  Schindler EMBO J. 19 No.5 (2000) 892-901
• DOPE (monounsaturated phosphoethanolamine
  analogue) frei diffundierbar
• DMPE (saturated acyl chains) wird in
  Mikrodomänen fest gehalten

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Rafts Visualiserung durch Atomic Force Microscopy

• Atomic force microscopy reveals sphingomyelin
  rafts (orange) protruding from a
  dioleoylphosphatidylcholine background (black) in
  a mica-supported lipid bilayer. Placental
  alkaline phosphatase (PLAP yellow peaks), a
  glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, is
  shown to be almost exclusively raft-associated.

Data from Saslowsky, D.E., et al. (2002) J.
Biol. Chem. 277, 26966-26970
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Oder mit Photonic Force Microscopy

• Kai Simons (Dresden, Germany) has used photonic
  force microscopy to measure the size of lipid
  rafts.
• By comparing the drag force of raft proteins
  (such as a GPI-anchored protein) and non-raft
  proteins (such as transferrin receptor) in the
  presence or the absence of cholesterol, he
  estimated the diameter of a single raft.
• The conclusion is that each raft is very small
  and contains a very small subset of proteins,
  leading to the prediction that in order to act as
  signalling and/or sorting devices, they need to
  cluster.

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Raft Eigenschaften

• Größe bis zu 2510 nm
• Das entspricht ungefähr 3,500 Sphyngolipid
  Molekülen
• Protein Anzahl hängt vom Packungsgrad ab,
  wahrscheinlich gibt es um die 30 Proteine in
  Rafts
• Cluster mit bis zu 15 identen Molekülen wurden
  beschrieben
• Statistisch gesehen, können jedoch nur ein
  relativ kleiner Anteil aller verfügbaren Raft
  Proteine gleichzeitig in Rafts auch sein.
• Das wiederum könnte wichtige Auswirkung auf die
  prinzipiellen Mechanismen der Signalweiterleitung
  in und durch Rafts haben.

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Raft-Typologie Nomenklatur
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Experimentelle Tools um Rafts zu zerstören

• Cholesterol sequestration/depletion
• Filipin (Antibiotic)
• Pore formation (Saponin, Digitonin, Streptolysin
  O)
• Methyl-beta-cyclodextrin

• Cholesterol biosynthesis
• Lovastatin
• Raft Stability
• Exogenous Cholesterol
• Exogenous Gangliosides
• Exogenous polyunsaturated fatty acids

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Signal Transduktionin Lipid Rafts und Caveolae

• FCeRI
• T-cell Receptor
• B-cell Receptor
• CD44
• H-ras
• Integrins
• eNOS

• EGF Receptor
• Insulin Receptor
• EphrinB1 Receptor
• Neutrophin
• GDNF
• Hedgehog

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Wie werden Signale in Rafts induziert und
integriert?
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Wie werden Signale in Rafts induziert und
integriert?
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Der CD44 Rezeptor ist in Rafts und intergiert mit
dem Zytoskelett
CD44
Lipid rafts
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out-side-in Signaltransduktion in CD44 Rafts nach
Ligandenbindung durch Hyaluronsäure (HA)?
CD44
?
Lipid rafts
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.
CD44
lamellipodia outgrowth Cytoskeletal
rearrangements
Oliferenko et al., JCB 2000
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Rafts in Fc Rezeptor Signaltransduktion
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(No Transcript)
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Rafts in T-Cell Rezeptor Signaltransduktion
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? Offene Fragen ?

• Wievel Arten von Rafts?
• Funktion von Caveolae in Signaltransduction?
• Welche Signalwege brauchen Rafts?
• Welche Proteine gehen in Rafts und warum?
• Wie werden Caveolae internalisiert
• Rolle des Zytoskelettes?