Gentherapie und Genomics

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Gentherapie und Genomics

• Konteptvorlesung 17
• Themenblock 7
• Beda M. Stadler
• Institut für Immunologie

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Inhalt / Lernziele

• Genomics
• Begriffe Transcriptomics, Proteomics, Structural
  Genomics, Knockout / transgene Tiemodelle,
  Comparative Genomics
• Krankheitsallele aufspüren
• Pharmacogenomics
• Gentherapie
• Keimbahn vs somatische Gentherapie
• Vektoren der Gentherapie
• Gentherapie Strategien und Beispiele

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Es werden immer weniger Gene...
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Viel Genome sind sequenziert
Superkindom Kindom page How many genomes Last update
Archeabacteria . arch 16 jul-09-02
Bacteria . bac 89 jan-13-03
Eukaryote Fungi yeast 2 apr-14-02
Eukaryote Protozoa protozoan 1 jan-13-03
Eukaryote Plant plants 2 apr-15-02
Eukaryote Animalia worm 1 apr-14-02
Eukaryote Animalia insect 1 apr-14-02
Eukaryote Animalia Mouse rat 2 jan-18-06
Eukaryote Animalia Domestic animals 2 jan-19-06
Eukaryote Animalia Human chimpanzee 2 jan-18-06
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GENOMICS
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Commonly Used DNA Markers

• RFLPs, or restriction fragment length
  polymorphisms, were among the first developed DNA
  markers. RFLPs are defined by the presence or
  absence of a specific site, called a restriction
  site, for a bacterial restriction enzyme. This
  enzyme breaks apart strands of DNA wherever they
  contain a certain nucleotide sequence.
• VNTRs, or variable number of tandem repeat
  polymorphisms, occur in non-coding regions of
  DNA. This type of marker is defined by the
  presence of a nucleotide sequence that is
  repeated several times. In each case, the number
  of times a sequence is repeated may vary.
• Microsatellite polymorphisms are defined by a
  variable number of repetitions of a very small
  number of base pairs within a sequence.
  Oftentimes, these repeats consist of the
  nucleotides, or bases, cytosine and adenosine.
  The number of repeats for a given microsatellite
  may differ between individuals, hence the term
  polymorphism--the existence of different forms
  within a population.
• SNPs, or single nucleotide polymorphisms, are
  individual point mutations, or substitutions of a
  single nucleotide, that do not change the overall
  length of the DNA sequence in that region. SNPs
  occur throughout an individual's genome.

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Single Nucleotide Polymorphism (SNPs)
im menschlichen Genom gt 2 Millionen SNPs93 der
Gene enthalten SNP(s)98 der Gene nahe bei SNP
SNP Fact Sheet
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Beispiele genetischer Krankheiten

• vererbt
• X-linked
• hemophilia A/B, Duchennes muscular dystrophy
• autosomal rezessiv
• Gauchers disease, cystic fibrosis
• kausal
• Huntingtons chorea, retinoblastoma
• polygenetisch
• diabetes mellitus, gout
• erworben
• Krebs
• p53 mutations, BRCA-1, other tumor oncogenes
• Atherosclerose
• FHC, plaque disruption
• Autoimmunerkrankungen

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Genomics verwandte Gebiete

• Transcriptomics involves large-scale analysis of
  messenger RNAs to follow when, where, and under
  what conditions genes are expressed.
• Proteomicsthe study of protein expression and
  function
• Structural genomics generate the 3-D structures
  of one or more proteins from each protein family,
  thus offering clues to function and biological
  targets for drug design.
• Knockout and transgenic studies are one
  experimental method for understanding the
  function of DNA sequences and the proteins they
  encode.
• Comparative genomicsanalyzing DNA sequence
  patterns of humans and well-studied model
  organisms side-by-side.
• Metabolomics - the analysis of small molecules,
  or metabolites, in biological samples

Human Genome Program, U.S. Department of Energy,
Genomics and Its Impact on Medicine and Society
A 2001 Primer, 2001
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Transcriptomics
mRNA Analyse (Genexpression) mit Methoden
wie Northern Blotting oder Microarrays (siehe KV
2)
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Proteomics
Genome/Transcriptome
Proteome
Modified Proteins
RNA
Proteins
DNA
Biological Function
x 5 bis 50 funktionale Beziehungenpro Protein
30'000 Gene
gt 500'000 Proteine
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Structural Genomics
Antikörperbindungsstelle mit und ohne Antigen
(Hapten)
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Knockout / transgene Tiemodelle
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Comparative Genomics
Eisen results from Yeast
A. Cholesterol biosynthesis B. Cell cycle C.
Immediate-early response D. Signalling and
angiogenesis E. Wound healing tissue remodelling
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Metabolomics
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Krankheitsallele aufspürenAmniozentese

• Problem
• Sensitivität
• Spezifität

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Krankheitsallele aufspürenSouthern blotting
bekannte Punktmutation
Beispiel Sichelzellanämie
drei Schnittstellen
Restriktions- analyse
Southern blot (Hybridisierung mit mark. Probe)
Auftrennung nach Grösse
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Krankheitsallele aufspüren
Condition Chromosome Location and Inheritance Pattern
Gaucher Disease 1, recessive
Achondroplasia 4, dominant
Huntington's Disease 4, dominant
Juvenile Onset Diabetes 6,11,7, others
Hemochromatosis 6, recessive
Cystic Fibrosis 7, recessive
Friedreich's Ataxia 9, recessive
Best Disease 11, dominant
Sickle Cell Disease 11, recessive
Phenylketonuria 12, recessive
Marfan Syndrome 15, dominant
Tay-Sachs Disease 15, recessive
Breast Cancer 17, 13
Myotonic Dystrophy 19, dominant
Familial Hypercholesterolemia 19, imcomplete dominance
Severe Combined Immune Deficiency ("Bubble Boy" Disease) 20, recessive
Adrenoleukodystrophy X
Duchenne Muscular Dystrophy X
Hemophilia A X
Rett Syndrome X
Leber's Hereditary Optic Neuropathy mitochondria, maternal inheritance
Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis, and Stroke (MELAS) mitochondria, maternal inheritance
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Pharmacogenomics
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Genomics und eine neue Medizin
Auf die Gendiagnostik folgt die Gentherapie

• bessere Diagnose
• frühere Entdeckung genetischer Prädispositionen
• rationales Drug Design
• Gentherapie und Kontrollsysteme für Medikamente
• personalisierte Medikamente

Human Genome Program, U.S. Department of Energy,
Genomics and Its Impact on Medicine and Society
A 2001 Primer, 2001
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Definition und Ziel der Gentherapie
Vektor (TherapeutischesGen)

• Expression eines neuen Gens in einer Körperzelle
  damit die erworbenen Eigenschaften zu einen
  therapeutischen Erfolg beim Patienten führen
• Mit einer einzelnen Administration eine
  lebenslange Rekonstitution des genetischen
  Defekts erreichen
• Absolute Heilung

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Keimbahn vs somatische Gentherapie
Keimbahntherapie I
Keimbahntherapie II
Somatische Gentherapie
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Gentherapie und Verfassung

• Keimbahntherapie
• Die DNA der Gameten verändern
• alle Nachkommen erhalten das veränderte Gen
• Somatische Gentherapie
• Nur die DNA von somatischen Zellen wird verändert
  
• Nicht vererbar

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Noch in den Kinderschuhen
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Ernüchterung?
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Krankheiten im Fokus der Gentherapie
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Arten der Gentherapie
DNA
Virus
Zelle
Gen
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in vivo und ex vivo Gentherapie
ex vivo
in vivo

• ex vivo (ausserhalb des Körpers)
• transduzierte somatische or hämatopoietische
  Zellen
• in situ (lokalisiert)
• direkte Administration (z.B. In den Tumor, s/c
  Depot)
• in vivo (ganzer Körper)
• systemische Administration

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Vektoren

• Jeder Carrier, der die Aufnahme der verändeten
  DNA oder ähnlicher Agentien in Zellen steigert
• Virale Vektoren
• Retroviren
• Adenoviren
• andere Viren
• Nicht-Virale Vektoren
• Liposomen
• Genkanone
• Injektion

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Anatomie eines Vektors
Beginn der DNA Replikation
Promotor
selektierbare Marker
induzierbare Elemente
Affinitäts Reinigungs Tag
multiple Klonierungsstellen
Stabilisierungs und optimisierungs Elemente
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Viraler Vektor
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Adenovirus Vektor
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Injektion von nackter DNA
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Nicht-Virale Vektoren Liposomen
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Gen-Targetting muss gelöst werden(Beipiele)

• Krankheit Zielzellen Gen Defekt
• Thallassemie Erythrocyten ?-Hämoglobin
• Haemophilie A Hepatocyten Faktor VIII
• SCID Lymphocyten ADA Defizienz
• CGD Mono/Neutro Cytochrome b,
• LAD Mono/Neutro CD18 ?-subunit
• Gaucher's Makrophagen Glucocerebrocidase
• Hunters Makrophagen Iduronate Desulfatase
• musculäre Dyst. Muskelz. Dystrophin
• Zystische Fibros. Atemwegepithel CFTR

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Retrovirale Vektoren
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Beispiel SCID (ADA)
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To integrate or not to integrate?
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Andere Vektoren am Horizont

• Adeno-assozierte Viren
• Vaccinia / Geflügelpocken
• Herpesvirus
• Lentivirus (HIV-attenuiert)

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Vektoren Zusammenfassung
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verwendete Vektoren
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Gentherapie Strategien

• Ersatz Gentherapie
• Knockout Gentherapie
• Selbstmord Gentherapie
• Immunomodulatorische Gentherapie
• RNA Interferenz Therapie

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Ersatz Gentherapie
norm. Zelle kein Effekt
Wachstumsstop
Tumorzelle
Tumorsuppressor Gen (TSG)
Apoptose
Bystandereffekt
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Knockout (antisense) Gentherapie
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Selbstmord Gentherapie
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Beispiel Selbstmord Gentherapie
Thymidine kinase is introduced into tumor cells
using a viral vector. Treatment with ganciclovir
kills the tumor cells expressing thymidine kinase
selectively.
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Immunomodulatorische Gentherapie1. Zytokine

• The basic idea of immunotherapy is to
• modify tumor cells outside the body with a
  cytokine gene
• transplant the cytokine-gene modified cells back
  into the patient (after the cells have been
  irradiated to prevent further cell division)
• let the host's system create an antitumor immune
  response

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Immunomodulatorische Gentherapie2. "altered self"
Injection of a cell surface protein attracts
immune systems cytotoxic T cells to the site of
a tumor.
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Immunutherapie mit nackter DNA
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RNA Interferenz Therapie

• Inhibition of HIV infection
• Cessation or lowering of antiviral chemotherapy!
• Control of T-cell reduction
• Restoration of T cell immunity
• Clearance of HIV infected cells
• Protection from OI

Anti Virus
Anti Rezeptor
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Zusammenfassung verwendete Gene
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Gentherapie Zusammenfassung