TBC, "the reemergent killer"

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TBC, "the reemergent killer"

• aumento della tubercolosi nei paesi
  industrializzati
• crescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis
  multiresistenti (MRMT)

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la diagnostica tradizionale

• esame microscopico
• esame colturale
• identificazione
• antibiogramma

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esame microscopico

• colorazione di Ziehl-Neelsen
• fluorescenza

tecnica scarsamente sensibile e non
specie-specifica
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Ziehl-Neelsen
1000x
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fluorescenza
400x
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metodi colturali "alternativi"

• metodo radiometrico
• terreno bifasico
• terreno con indicatore fluorescente
• terreno Redox

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il metodo radiometrico

• flaconcini sigillati di terreno liquido
  contenente un substrato (ac. palmitico) marcato
  con 14C
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del
  metabolismo batterico
• rilevamento di radioattività nella fase gassosa
  come spia di batteri metabolicamente attivi

notevole accorciamento dei tempi di crescita
maggior
sensibilità
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il terreno bifasico

• flacone di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo,
  agarizzato, agar cioccolato)
• arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie
  isolate sul terreno solido

moderato accorciamento dei tempi di crescita
maggior
sensibilità
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medium con indicatore fluorescente

• provetta di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• fluorocromo, incorporato in un film di silicone
  sul fondo della provetta, sensibile alle
  variazioni del contenuto di ossigeno
• comparsa di fluorescenza per effetto del consumo
  di ossigeno operato dal metabolismo batterico
• rilevamento della fluorescenza
• visivo, sotto una lampada UV
• automatizzato

accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
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il terreno Redox

• i micobatteri crescono nel terreno liquido di
  Kirchner formando piccoli fiocchi o
  intorbidamento uniforme
• i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono
  ridotti a formazzano dai micobatteri in crescita
• il formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si
  fissa alla superficie delle colonie
  micobatteriche permettendone il riconoscimento

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automazione nella coltura dei micobatteri

• metodo radiometrico
• la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata
  da un ?-counter
• metodo pressometrico
• laumento di pressione, dovuto a produzione di
  CO2, viene rilevato da un manometro
• metodo fluorimetrico
• la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla
  presenza di ossigeno nel terreno, viene
  ripristinata per effetto del consumo di ossigeno
• metodo refrattometrico
• la produzione di CO2 fa virare un sensore che a
  sua volta modifica lintensità di un raggio di
  luce riflessa

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lemocoltura per micobatteri 1

• la ricerca dei micobatteri nel sangue è
  giustificata per i pazienti immunodepressi nei
  quali può essere richiesta anche la mielocoltura
• la bassa sensibilità rende inutile lesecuzione
  dellesame microscopico
• un tipo particolare di emocoltura è quello che si
  esegue sul sangue mestruale quando si sospettano
  forme tubercolari a carico dellapparato genitale

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lemocoltura per micobatteri 2

• semina diretta del sangue
• nei flaconi Bactec 13A
• nei flaconi BacT ALERT MB blood
• nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic
• semina dopo lisi-centrifugazione (sistema
  Isolator)
• su tutti i terreni solidi (a base di uovo o
  sintetici)
• in tutti i terreni liquidi compresi quelli, non
  dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi
  automatizzati
• nel terreno bifasico

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lemocoltura per micobatteri 3

• la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente
  inferiore a quella dei terreni liquidi
• tempi di incubazione inferiori alle otto
  settimane sono sconsigliati anche per i terreni
  liquidi
• le specie appartenenti al MAC sono di gran lunga
  quelle di più frequente reperimento
• lo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che
  non crescono nelle subcolture su terreno solido
  deve far pensare alla presenza della specie M.
  genavense

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identificazione tradizionale, test biochimici

• accumulo di niacina
• riduzione dei nitrati
• catalasi
• quantitativa
• termoresistente
• idrolisi del Tween 80
• ureasi
• arilsolfatasi
• riduzione del tellurito

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identificazione tradizionale, test colturali

• velocità di crescita
• aspetto delle colonie
• rugose lisce
• fotocromogene
• scotocromogene
• non pigmentate
• crescita a varie temperature
• test di inibizione selettiva

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NAP test

• il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone
  (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce
  lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M.
  tuberculosis complex ma non quello dei
  micobatteri non tubercolari
• risultati accettabili solo in terreno liquido

test di screening rapido (4-7 gg)
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metodi di identificazione alternativi

• DNA probe
• HPLC degli acidi micolici
• sequenziamento genico
• 16S rDNA
• SOD
• HSP65

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il sistema AccuProbe

• lisi delle cellule batteriche e liberazione del
  rRNA
• probe marcato costituito da un frammento di DNA a
  filamento singolo contenente una sequenza
  specie-specifica presente in una regione
  ipervariabile del rRNA
• ibridizzazione in presenza di complementarità fra
  rRNA e probe
• rimozione della marcatura dal DNA non ibridizzato
• eccitazione della molecola marcatrice
  chemioluminescente
• rilevamento della luce prodotta in presenza di
  molecole ibride di acidi nucleici

metodo rapido (2 h) altamente specifico
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HPA (hybridization protection assay)

• gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori
  emettono luce se eccitati chimicamente
• nel DNA a catena singola la molecola marcatrice è
  esposta all'azione di eventuali agenti
  inattivanti
• la struttura assunta dall'acido nucleico a catena
  doppia protegge la molecola marcatrice
  dall'azione di eventuali agenti inattivanti
• l'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni
  possibilità di emissione di segnale da parte di
  molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è
  pertanto indice di avvenuta ibridizzazione

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Line Probe Assay (LiPA)
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LiPA, interpretazione
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gli acidi micolici

• acidi grassi, ramificati in posizione ?
• presenti nella parete batterica dei generi
• Corynebacterium 22-38 atomi di C
• Rhodococcus 34-52 atomi di C
• Nocardia 44-60 atomi di C
• Gordona 48-66 atomi di C
• Tsukamurella 64-78 atomi di C
• Mycobacterium 60-90 atomi di C
• presenza di numerosi gruppi funzionali che
  differenziano 7 tipi di acidi micolici
  micobatterici
• alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere,
  omega' metossi-

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HPLC degli acidi micolici

• saponificazione, estrazione e derivatizzazione
  degli acidi micolici presenti nella parete dei
  micobatteri
• frazionamento mediante HPLC
• individuazione dei picchi presenti nel tracciato
  cromatografico e identificazione per confronto
  con profili di riferimento

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profilo HPLC del M. tuberculosis complex
ad eccezione del M. bovis BCG
SI
26
esempi di profili HPLC
27
TLC degli acidi micolici
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gas-cromatografia
29
RNA ribosomiale 16S
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antibiogramma

• i farmaci antitubercolari maggiori
• il principio del metodo delle proporzioni
• lantibiogramma manuale
• lantibiogramma automatizzato
• lantibiogramma sui micobatteri non
  tubercolari

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antibiogramma radiometrico

• inoculo di una serie di flaconcini radiometrici,
  addizionati con antibiotici, con una sospensione
  micobatterica standardizzata
• inoculo di un flaconcino di controllo con una
  diluizione 1/100 della sospensione precedente
• lettura radiometrica giornaliera fino al
  raggiungimento, da parte del controllo, di una
  soglia prefissata
• sensibilità
• flaconcini con incremento giornaliero inferiore a
  quello del controllo
• resistenza
• flaconcini con incremento giornaliero superiore a
  quello del controllo

metodica di riferimento, durata 5-10 gg
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le fasi dellaPolymerase Chain Reaction

• pretrattamento del materiale e liberazione
  dell'acido nucleico
• fluidificazione ed eventuale decontaminazione
• lavaggio
• lisi delle cellule
• amplificazione dell'acido nucleico
• rilevamento dell'amplificato

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componenti principali dellamiscela di
amplificazione

• NUCLEOTIDI
• PRIMER oligonucleotidi complementari di sequenze
  presenti alle due estremità della regione da
  amplificare
• POLIMERASI enzima che determina l'allungamento
  dei primer utilizzando i nucleotidi presenti
  nella miscela di reazione

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i componenti della Mastermix del sistema Amplicor
M. tuberculosis

• NUCLEOTIDI
• assenza di nucleotidi contenenti timina
  (sostituiti da quelli contenenti uracile)
• PRIMER
• complementari di sequenze che delimitano una
  regione del genoma specifica del genere
  Mycobacterium
• marcati con biotina
• POLIMERASI
• Taq polimerasi

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il sistema AmpErase per la prevenzione delle
contaminazioni

• il DNA-target non contiene uracile
• il DNA-amplificato contiene uracile al posto
  della timina
• l'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al materiale
  da amplificare determina la distruzione di
  qualsiasi traccia di DNA contaminante (frutto di
  precedenti amplificazioni) l'enzima è invece del
  tutto inattivo sul DNA-target

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i cicli termici della reazione di amplificazione

• 20 sec a 94C la doppia elica del DNA si separa
  ed i filamenti singoli costituiscono lo stampo
  per successive amplificazioni
• 20 sec a 62C i primer si legano alle sequenze
  complementari presenti sul DNA-target (annealing)
• 45 sec a 72C la polimerasi determina
  l'allungamento dei primer utilizzando i
  nucleotidi presenti nella miscela di reazione

30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la
formazione di un miliardo di copie del DNA
originale
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il rilevamento dell'amplificato

• trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di
  una piastra microtiter, coated con probe
  complementari di una sequenza dell'amplicone
  specifica per il M. tuberculosis
• incubazione (ibridizzazione)
• lavaggi (eliminazione dell'amplificato non
  ibridizzato)
• aggiunta del coniugato avidina-enzima
• incubazione (legame avidina-amplicone
  biotinilato)
• lavaggi (eliminazione del coniugato non legato)
• aggiunta del substrato
• incubazione (reazione enzimatica)
• bloccaggio della reazione enzimatica
• lettura fotometrica a 450 nm

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le fasi della Transcriptase Mediated
Amplification

• fluidificazione e decontaminazione del campione
• lisi (ultrasuoni) delle cellule
• trasferimento del lisato in provette contenenti
  la miscela di amplificazione e breve incubazione
  a 95C
• aggiunta della miscela enzimatica e
  amplificazione isotermica (2 h a 42C) di una
  regione del rRNA specifica del genere
  Mycobacterium
• blocco dell'amplificazione ed ibridizzazione
  dell'eventuale amplificato con un DNA-probe
  specifico per il M. tuberculosis complex
• rilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione

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il principio della TMA

• annealing dei primer, presenti nella miscela di
  reazione, con il rRNA liberato mediante lisi
  cellulare
• sintesi di DNA a partire da RNA grazie alla
  transcriptasi inversa
• separazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera della
  RNasi
• utilizzo del DNA come stampo per la sintesi di
  molte copie di RNA ad opera della polimerasi
• ulteriore annealing del RNA sintetizzato con
  nuovi primer

non occorrono cicli termici perché manca la fase
di denaturazione formazione di 10 miliardi di
copie in 2 ore
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la Strand Displacement Amplification

• TARGET IS6110
• PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI
  AMPLIFICAZIONE
• bamper
• primer
• polimerasi
• enzima di restrizione

non occorrono cicli termici perché manca la fase
di denaturazione
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SDA amplificazione esponenziale
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
43
il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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il rilevamento dellamplificato nella SDA
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ricerca del M. tuberculosis mediante
amplificazione, pro e contro

• rapidità
• metodiche in-house
• elevata sensibilità
• manualità complessa
• alto rischio di contaminazioni
• metodiche commerciali
• sensibilità non superiore a quella della coltura
• parzialmente automatizzabili
• minimo rischio di contaminazioni
• standardizzate solo per i materiali respiratori

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indicazioni delle tecniche di amplificazione

• utilizzabili per la ricerca di nuovi casi
• non utilizzabili per il monitoraggio della terapia

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interpretazione del risultato dellamplificazione
1
56
interpretazione del risultato dellamplificazione
2