Metoda SSCP (single strand conformation polymorphism)

1
Metoda SSCP(single strand conformation
polymorphism)
Paulina Mlynarczyk Aleksandra Pawelec Sylwia
Pietrasik Gr. 2 A
2
SSCP

• Technika ta umozliwia wykrywanie punktowych zmian
  w DNA.
• Materialem wyjsciowym do analizy SSCP sa produkty
  PCR, które przed elektroforeza denaturuje sie
  termicznie w buforze obciazajacym z dodatkiem
  czynnika denaturujacego formamidu, mocznika
  lub wodorotlenku sodowego.
• Rozdzial prowadzi sie w zelu poliakryloamidowym,
  który nie zawiera czynnika denaturujacego.

3
SSCP

• W tych warunkach jednoniciowa czasteczka DNA
  tworzy wewnetrzne sparowania, przez co przyjmuje
  okreslona konformacje przestrzenna zalezna od
  sekwencji nukleotydów.
• Szybkosc migracji jednoniciowych fragmentów DNA
  zalezy od ich wielkosci oraz konformacji.
• Fragmenty o takiej samej dlugosci i sekwencji
  nukleotydów przyjmuja takie same konformacje i
  wykazuja taka sama ruchliwosc elektroforetyczna.

4
SSCP

• Fragment z mutacja utworzy odmienny od
  prawidlowych wzór prazków SSCP, poniewaz tworzy
  inne konformery migrujace ze zmieniona
  szybkoscia.
• Jedna czasteczka moze przybierac kilka
  konformacji, przewaznie jedna z nich tworzy
  preferencyjnie, co jest widoczne na zelu w
  postaci jednego wyraznego sygnalu i kilku
  sygnalów slabszych.
• Zmiana intensywnosci sygnalów, wynikajaca ze
  zmian preferencji tworzenia konformacji moze
  równiez wskazywac na mutacje w badanym fragmencie
  DNA.

5
SSCP

• Nalepsze wyniki, ponad 95 wykrywalnosci zmian,
  osiaga sie dla fragmentów DNA o wielkosci 100-300
  par zasad.
• Dla odcinków 300-450 pz wykrywalnosc spada
  ponizej 80.
• Dluzsze produkty PCR mozna przed elektroforeza
  trawic enzymem restrykcyjnym tak dobranym, by
  otrzymac do analizy SSCP fragmenty DNA o
  optymalnej wielkosci.

6
SSCP

• Na jakosc i wydajnosc tworzenia konformerów
  wplywa wiele czynników, takich jak
• Temperatura nie powinna przekraczac 200C, gdyz
  zmniejsza sie wydajnosc tworzenia konformerów.
  Przy zbyt wysokiej temp. Prazki sa rozmyte lub
  tworza smugi.
• Stezenie DNA przy zbyt duzym w próbie wieksza
  czesc jednoniciowych fragmentów renaturuje w
  czasteczki dwuniciowe.
• Sila jonowa buforu
• Usieciowanie zelu lepszy rozdzial konformerów
  pochodzacych od poszczególnych nici uzyskuje sie
  w zelach slabo usieciowanych o stezeniu nie
  wiekszym niz 10.
• Stezenie glicerolu w zelu.

7
SSCP

• Aby uzyskac jak najwieksza wykrywalnosc zmian,
  analize SSCP kazdego fragmentu prowadzi sie w
  róznych warunkach. Najczesciej stosuje sie
  rozdzial elektroforetyczny w zelu z dodatkiem
  5-10 glicerolu w temperaturze 200C oraz w zelu
  bez glicerolu w temperaturze 40C.
• Do detekcji konformerów wykorzystuje sie
  najczesciej
• Reakcje srebrzenia,
• Radioizotopy,
• Znaczniki fluorescencyjne.

8
(No Transcript)
9
(No Transcript)