Reazioni false positive

1
LA SIFILIDE
He who knows syphilis knows medicine Sir
William Osler (1849-1919)
2
La sifilide è una malattia infettiva trasmessa
principalmente per via sessuale, causata dal
Treponema pallidum subsp.pallidum, batterio
mobile spiraliforme appartenente allOrdine
Spirochetales, Famiglia Treponematacee. Il
batterio filiforme, appare filamentoso ed
avvolto a spirale e le sue Dimensioni in
lunghezza sono nellordine di 5 mi- cron 15
micron con un diametro trasverso tra 0,1
micron e 0,2 micron.
3
Si moltiplica per scissione semplice con
divisione trasversale ed al contrario di molti
consimili della sua famiglia, per le sue
particolari esigenze nutritive e metaboliche, non
può essere coltivato in vitro o meglio può
esserlo solo per breve tempo con un massimo
sopravvivenza di 7 giorni a 35, in terreno
particolarmente arricchito ed in presenza di
CO2. Non sopravvivono più di 48 ore nel sangue da
trasfondere conservato nelle emoteche. In azoto
liquido mantengono la loro vitalità, mentre
proliferano in maniera eccellente nei
testicoli di coniglio.
4
Una patologia che viene da lontano.. nel tempo?
Rothschild B.M. Existence of syphilis in a
Pleistocene bear Nature. 335 (6191)595, 1988
Oct 13
Wright D.J. Syphilis and Neanderthal man Nature .
229 (5284)409, 1971 Feb 5
5

• o nello spazio?

6
LA CLINICA
7
EVOLUZIONE NATURALE DELLA SIFILIDE

• Studio di Oslo
• 1404 pazienti non trattati seguiti dal 1890 al
  1941
• sifilide I ---gt sifilide II
• latenza ---gt 25 recidive
• lt 2 anni
• sifilide latente tardiva (sifilide III)

8
DEFINIZIONI

• Per uniformare la notificazione dei casi di
  sifilide lOMS già nel 1982 ha raccomandato di
  attenersi alla seguente classificazione
• a) infezioni primarie e secondarie
• b) infezioni latenti recenti ( lt2 anni)
• c) infezioni latenti tardive (gt2 anni)
• d) infezioni tardive sintomatiche
• e) infezioni connatali in soggetti con meno di
  due anni
• f) infezioni connatali in soggetti con due anni
  o più
• Si definisce sifilide latente recente
  uninfezione diagnosticata sierologicamente, la
  cui durata non oltrepassi i due anni dopo due
  anni si definisce sifilide latente tardiva.

9
LATENZA

• Periodo di silenzio clinico caratterizzato
  dallassenza di lesioni e/o sintomi compreso tra
• contagio e comparsa del sifiloma
  (1 latenza o incubazione)
• regressione delle lesioni primarie e comparsa
  delle eruzioni cutanee secondarie (2 latenza o
  recente)
• regressione delle eruzioni cutanee secondarie e
  comparsa delle manifestazioni terziarie cutanee
  e/o sistemiche (3 latenza o tardiva)

10
DIAGNOSI

• La diagnosi di sifilide si basa su
• - clinica
• - anamnesi
• - laboratorio
• Sarebbe un grave errore trascurare anche uno
  solo dei tre elementi

11
IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE

• LOSSERVAZIONE DI UN ESSERE VIVENTE PUO AVVENIRE
  PER RICONOSCIMENTO DIRETTO.

O INDIRETTO.
12
IL LABORATORIO NELLA SIFILIDE

• DIAGNOSI DIRETTA
• Dimostrazione in sede di lesione della presenza
• del Treponema pallidum,
• indice certo di malattia
• DIAGNOSI INDIRETTA o SIEROLOGICA
• Dimostrazione degli anticorpi anti Treponema
  pallidum, indice di infezione

13
DIAGNOSI DIRETTA dimostrazione del Treponema
pallidum

• 1905 Identificazione del Tp al microscopio
  ottico
• (Schaudinn F Hoffmann E)
• 1907 Trasmissione del Tp dalluomo al testicolo
  di coniglio
• (Parodi U Giornale dellAccademia
  Medica di Torino 132881907 )
• 1909 Microscopia in campo oscuro (Coles)
• 1948 Rabbit Infectivity Test (Magnuson)
• 1964 Immunofluorescenza diretta (Yobs AR)
• 1990 PCR (Hay)

14
Diagnosi diretta del treponema

• Cross section of a spirochete PFperiplasmic
  flagell OSouter sheath

TEM x60.000
IL Treponema pallidum, appartiene alla famiglia
delle Treponematacee, batteri di forma
elicoidale, mobili, a divisione
trasversale. lunghezza variabile da 8 a 14
micron larghezza variabile da 0.15 a 0.20 micron.
15
Treponema pallidum

• Microscopia elettronica al Scansione (SEM)

Microscopia elettronica a scansione (SEM)
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
spirocheta infiltrata nei tessuti
16
Struttura antigenica
La conoscenza antigenica del treponema pallido ha
consentito luso di metodi diagnostici diretti
specie specifici (DFA-TP)

• Un antigene polisaccaridico
• Un antigene lipidico
• Un antigene proteico
• Antigeni del corpo del treponema

17
Trasmissione del Tp dalluomo al testicolo di
coniglio
Il treponema pallido non cresce in vitro ma può
essere coltivato nel testicolo di coniglio e
identificato su preparato istopatologico colorato
con sali di argento
Istopatologia Treponema pallidum coltivato su
testicolo di conoglio (whartin-Starry silver
stain)
18
1909 Microscopia in campo oscuro
Contrasto di fase Questa tecnica si usa per
evidenziare preparati trasparenti che non possono
assorbire luce. Il preparato è reso visibile
perchè viene contrastato con un'altra angolazione
di luce e quindi canbiandogli il proprio indice
di rifrazione. Campo oscuro Viene inserito un
disco opaco (chiamato stop) sul percorso della
luce, cosicchè solo un cono vuoto di luce
illumina il soggetto e permette la risoluzione di
dettagli fini. Lilluminazione è obliqua e entra
nellobiettivo solo se rifratta dalloggetto
osservato, il fondo rimane scuro.
19
1909 Microscopia in campo oscuro(PARABOLOIDE)

• La microscopia in campo oscuro è il metodo più
  veloce e diretto per diagnosticare la sifilide
  primaria e secondaria.  I campioni devono essere
  esaminati immediatamente dopo il prelievo da
  parte di personale addestrato al riconoscimento
  del Treponema pallidum.

20
1964 Immunofluorescenza diretta (DFA-TP)

• Limmunofluorescenza diretta mediante ab
  specifici (DFA-TP) può essere utilizzata per
  identipicare il T. pallidum.  I vantaggi di
  questa tecnica rispetto alla microscopia in campo
  oscuro è che lo striscio non deve essere
  esaminato subito ed è specie specifico. Richiede
  tuttavia attezzature specifiche e personale con
  esperienza.

anticorpo monoclonale fluorescente diretto verso
lantigene lipoproteico di 47 kd. Courtesy of
Sheila Lukehart
21
Il genoma del Treponema p. è stato completamente
sequenziato

• Fraser CM, Norris SJ, et al Science 1998 Jul
  17281(5375)375-388

Il genoma di T. pallidum consiste di 1.138.006
paia di basi e contiene 1041 predicted open
reading frames (ORF)
22
BIOLOGIA MOLECOLARE

• La conoscenza della sequenza genomica e di
  alcune proteine specifiche da esso codificate ha
  consentito luso di indagini biomolecolari
• PCR x gene codificante proteina 47Kd
• 
  sensibilità 10-50 spirochete
• PCR x DNApolimerasi I sensibilità 10-50
  spirochete
• RT-PCR sensibilità 1
  spirocheta

23
Attendibilità diagnostica

• SENSIBILITÀ amnios (100),
• lesione mucose o
  cutanee esulcerate (96),
• sangue (67)
• liquor (60)
• SPECIFICITÀ lesione cutanea (96),
• amnios e sangue(100)
• LIMITI
• Costi
• Incapacità distinguere TP vitali e tracce di TP
  morti
• Non indicato su liquor
• Tempi di esecuzione

24
PCR x gene codificante proteina immunogena di
membrana 47Kd

• Zoechling N. et al 1997 PCR nested per il gene
  di una proteina di membrana immunogenica di 47
  Kd----- banda 196 pb
• H S Jethwa et al. J Clin Microbiol. 1995
  January 33(1) 180183 ------banda 658pb
• Karina A. Orle Et al 1996. Multiplex PCR
  Haemophilus, Treponema (47KdProt.), Herpes.
  AMPLICOT Kit format (Roche Molecular system)
  colorimetric detection sistem

25
PCR x gene codificante DNA polymerase I.
Liu H, Rodes B, Chen CY, Steiner B.New tests for
syphilis rational design of a PCR method for
detection of Treponema pallidum in clinical
specimens using unique regions of the DNA
polymerase I gene.J Clin Microbiol. 2001
May39(5)1941-6.
Sensibilità 95,8 specificità 95.7
agarose gel electrophoresis of polA PCR from
serial dilutions of known concentrations of T.
pallidum DNA extract. (A) Primer set I. The arrow
indicates a 377-bp product. (B) Primer set II.
The arrow indicates a 395-bp product. Lanes 1, 2
26
N.L. Treponema pallidum Kit

• Estrazione mediante gel di silice
• Banda specifica per Treponema p. 273 pb
• Controllo interno 668pb

Tempo di esecuzione in giornata
27
N. L. Treponema pallidum Kit

• Estrazione mediante gel di silice

• amplificazione

28
N. L. Treponema pallidum Kit

• Banda specifica per Treponema p. 273 pb
• Controllo interno 668 pb

668 pb Controllo interno
273 pb Treponema
29
Treponema pallidum PCRcasistica centro MST 1
Clinica Dermatologica Torino
n. campioni POSITIVI NEGATIVI
NO LUE 18 0 18
LUE I 44 38 6
LUE II 13 12 1
LUE SIEROLOGICA RECENTE 2 0 2
3 lesioni alla cervice uterina 3 solco
balano-prepuziale roseola del tronco
30
Isolamento del Tp da lesioni muco-cutanee

• MICROSCOPIA IN
• CAMPO OSCURO
• sensibilità buona (80)
• specificità buona
• operatore-dipendente
• risposta immediata
• labilità del campione
• economico
• adatto a qualsiasi laboratorio

• PCR
• sensibilità elevata (96)
• specificità elevata
• operatore indipendente
• risposta in giornata
• invio dei campioni
• costo elevato
• laboratorio attrezzato

31
Indicazioni alla diagnosi diretta

• La dimostrazione del T. pallidum
• è raccomandata in
• sifilide primaria sieronegativa
• sifilomi extragenitali (orale, anale)
• Sifiloma cervicale
• re-infezioni
• coinfezione con HIV
• Sifilide secondaria atipica
• E poco utile nelle forme
• secondarie e terziarie

32
DIAGNOSI SIEROLOGICAdimostrazione di anticorpi
anti T. pallidum

• Il riscontro di anticorpi anti T. pallidum indica
  solo una risposta immunitaria dellospite alla
  presenza del Treponema, presente o passata.
• Non esiste un unico test sierologico che fornisca
  informazioni certe sullo stadio della malattia.
• Solo lesecuzione di più test in contemporanea
  associati alla clinica ci può permettere di
  definire lesatto stadio.

33
DIAGNOSI SIEROLOGICAdimostrazione di anticorpi
anti T. pallidum

• 1906Reaz. di Wassermann
• 1946 Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)
  
• 1949 Treponema Pallidum Immobilisation (TPI)
• 1956 Rapid Plasmin Reagin (RPR)
• 1964 Fluorescence Treponemal Antibody-absorption
  
• (FTA-abs)
• 1965 Treponema Pallidum HemAgglutination (TPHA)
• 1975 ELISA
• 1988 Western Blot

34
CLASSIFICAZIONE DEI TEST

• NON-TREPONEMICI VDRL
• (aspecifici)
  RPR
• Test
• TREPONEMICI TPHA
• (specifici)
  FTA-abs
• 
  ELISA/EIA
• 
  Western Blot

35
Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR)

• Questi test rivelano anticorpi IgG e IgM diretti
  contro lipidi di membrana del Treponema
  pallidum e contro lipidi serici presenti
  nellospite per il danneggiamento di membrane
  mitocondriali causato da diverse patologie.
• A questo scopo si utilizza la cardiolipina di
  bue che cross-reagisce con questi antigeni

Pangborn MC. A new serologically active
phospholipid from beef heart. Proc Soc Exp Biol
Med. 194148484. Harris, A., A. A. Rosenberg,
and L. M. Riedel. 1946. A microflocculation test
for syphilis using cardiolipin antigen.
Preliminary report. J. Ven. Dis. Inform.
27169-174.
36
VDRL
Harris, A., A. A. Rosenberg, and E. Del Vecchio.
1948. The VDRL slide flocculation test for
syphilis. II. A supplementary report. J. Ven.
Dis. Inform. 2972-75. Venereal Disease Research
Laboratory. VDRL tests. In Scheele L A. ,
editor Scheele L A. , editor. Manual of
serologic tests for syphilis. U.S. Washington,
D.C Government Printing Office 1949. pp.
109120.
La VDRL ha soppiantato la reazione di fissazione
del complemento, descritta per la prima volta da
Wassermann, Neisser Bruck, in 1906, conosciuta
sotto il nome di reazione di Wassermann
37
VDRL
Lantigene VDRL, che è una miscela di
cardiolipina, lecitina e colesterolo, è la base
di tutti i test non treponemici. Con varie
modificazioni lantigene è stato stabilizzato per
essere usato in altri test aggiungendo
stabilizzatori e pigmenti USR (unheated serum
reagin test) con siero non scomplementato RPR
(rapid plasma reagin test) con plasma non
scomplementato TRUST (toluidine red unheated
serum test) (TRUST) con siero non scomplementato
e aggiunta di blu di toluidina. La velocità del
test ha favorito lRPR, ma la VDRL rimane lunico
test consigliato dalla FDA americana per
diagnosticare la neurosifilide su liquor. Inoltre
la VDRL rimane il test più economico e perciò è
preferito nei laboratori con scarse disponibilità
finanziarie (paesi poveri).
38
VDRL
Antigene cardiolipina di bue lecitina
colesterolo
anticorpi del paziente
flocculazione
39
VDRL
1 inattivazione complemento
2 siero
4 agitazione
3 reattivo
40
VDRL
Tempo di esecuzione 45-50 minuti
5 lettura
VDRL NEG
VDRL POS
41
RPR (Rapid Plasma Reagin)
Portinoy J, Garson W, Smith Ca.Rapid plasma
reagin test for syphilis.Public Health Rep. 1957
Sep72(9)761-6.

• RPR e' un test non-treponemico di
  flocculazione per la determinazione qualitativa e
  semiquantitativa delle reagine (anticorpi) in
  siero o plasma
• Il test viene effettuato su siero o plasma.
  l'antigene è costituito da una sospensione
  colloidale di cardiolipina, lecitina e
  colesterolo miscelata a microparticelle di
  carbone. Quando un siero reattivo viene posto a
  contatto con l'antigene, si ha la formazione di
  una flocculazione macroscopica.

42
RPR
RPR è una variazione della tecnica standard VDRL,
ha analoga specificità e sensibilità lievemente
diversa offre i seguenti vantaggi Reagente
pronto alluso Stabilità elevata Non è
richiesta linattivazione del campione Può
essere usato sia siero che plasma Lettura ad
occhio nudo dei risultati. Svantaggi non può
essere usata su liquor
43
Test NON-TREPONEMICI (VDRL, RPR) pregi e difetti

• test quantitativi, se titolati
  follow-up
• alta sensibilità
• basso costo ed esecuzione semplice e rapida
• positivizzazione precoce (80 positivi nella
  Sifilide I)
• negativizzazione entro 2 anni dalla terapia
• variabilità dinterpretazione legata
  alloperatore
• fenomeno prozona
• bassa specificità (30 falsi positivi)

44
TEST TREPONEMICI(TPPA, FTA-ABS, ELISA, WB)

• test qualitativi (TPPA e FTA titolo)
• alta sensibilità (falsi neg eccezionali)
• buona specificità (rari falsi pos)
• positivizzazione variabile (IgM gt FTA gtTPPA)
• negativizzazione assente (o molto tardiva)
• costo variabile
• tempi più lunghi, laboratorio attrezzato

45
TPHA/TPPA
TPHA (T. Pallidum HemAgglutination) TPPA (T.
Pallidum Particle Agglutination) Il TPHA, ideato
nel 1965 è stato recentemente sostituito dal
TPPA, più sensibile e utilizza particelle di
gelatina al posto di emazie di pollo o altri
volatili
46
TPPA (T. Pallidum Particle Agglutination)
Particelle di gelatina
particelle sensibilizzate
antigeni treponemici
particelle sensibilizzate
anticorpi del paziente
agglutinazione
47
TPHA/TPPA
Tempo di esecuzione circa 2h30
2 siero
1 tampone sorbent
3 particelle sensibilizzate e non
4 lettura
48
TPHA/TPPA
titolazione
2 siero
49
FTA (Fluorescent Treponemal Antibody)
Deacon WE, Falcone VH Harris A.Fluorescent
Test for Treponemal Antibodies.Proc. Soc. Exper.
Biol. Med.96 477-489, 1957
FTA-abs
Hunter Ef, Deacon We, Meyer Pe. An Improved Fta
Test For Syphilis, The Absorption Procedure
(Fta-abs). Public Health Rep. 1964 May79410-2.

50
FTA IgG e IgM

• E il test storicamente usato per
  ldentificazione delle IgM (lue congenita), oggi
  affiancato da ELISA e WB

51
Tempo di esecuzione 2h30 ore
FTA-abs
vetrino con Treponemi adesi
anticorpi del paziente (siero adsorbito)
legame antigene - anticorpo
anticorpi anti Ig umane
rivelazione
52
ELISA/EIA

• test qualitativo rapido, di facile
  interpretazione ed automatizzato per la ricerca
  di Ig (GM), IgG e IgM
• indicato per lo screening di grandi popolazioni a
  bassa prevalenza di sifilide (donatori, gravide,
  etc)
• I casi positivi devono essere confermati con un
  altro test
• sensibilità elevata - no fenomeno prozona
• specificità buona
• basso costo solo per grandi popolazioni

53
ELISA/EIA
Tempo di esecuzione lt 2 ore
54
WESTERN BLOT

• Test qualitativo utilizzato come test di conferma
  nei casi dubbi
• sifilide congenita ricerca IgM
• neurosifilide esclusione di infezione in caso di
  negatività
• sensibilità buona nella s. congenita (83-98 gt
  FTA-abs)
• specificità alta gt TPHA gt FTA-abs
• promettente per neurosifilide e treponematosi
  endemiche

Tempo di esecuzione 1h30
55
Treponema pallidum immobilization (TPI o test di
Nelson)

• Test altamente specifico
• Oggi in disuso
• Necessita di uno stabulario attrezzato per
  lallevamento dei conigli e le colture dei
  Treponemi
• Utilizzo di apposite celle per lesecuzione del
  test
• Gli anticorpi del paziente insieme al complemento
  immobilizzano i treponemi.

56
Il problema dei FALSI NEGATIVI e FALSI
POSITIVI
57
REAZIONI FALSAMENTE NEGATIVEFENOMENO di PROZONA

• Falsa negatività della VDRL per un meccanismo
  competitivo dovuto all inibizione della
  agglutinazione
• per una eccessiva quantità di anticorpi
  circolanti
• (TPHA ? 15120)
• Si verifica in corso di sifilide secondaria
• sifilide
  latente recente
• 
  reinfezioni
• HIV
• Si evita titolando la VDRL negativa fino a 1/16
• La diluizione va eseguita solo in caso di
  sospetto clinico

58
REAZIONI FALSAMENTE POSITIVE
Molto frequenti (1 pop. generale, 30
tossicodipendenti) La discordanza coi test
treponemici permette la diagnosi

• più frequenti nei test non treponemici (VDRL,
  RPR)
• titolo stabile e basso (VDRLlt 1 8)
• reazione falsamente positiva generalmente isolata
  
• identificabili con i test di conferma
• impossibilità a distinguere le treponematosi
  endemiche (Framboesia, Bejel, ecc)
• la reazione falsamente positiva può coesistere
  con cicatrice sierologica rilevabile solo
  dallanamnesi

59
 
POSITIVITA RISCONTRATE SU 400 SIERI CHE
DIMOSTRAVANO F.R.P. ALLA VDRL (cortesia Dr.
Panuccio Sanità pubblica Milano)
60
TEST di CONFERMAnecessario per

• Esclusione di test falsamente positivi
• VDRL TPHA, FTA-abs
• ELISA TPHA VDRL
• TPHA FTA-abs, Western Blot
• ELISA IgM (neonato) WB- IgM
• Esclusione di test falsamente negativi
• fen. prozona VDRL VDRL
  diluita, ELISA

61
APPLICAZIONE DEI TEST

• SCREENING
  VDRL/RPR TPHA
• ELISA (GM)
• 
  
• TEST di CONFERMA TPHA
• 
  FTA-abs (FTA-IgM x sifilide congenita)
• 
  Western Blot
• FOLLOW-UP
  VDRL titolata

62
SCREENING PER POPOLAZIONI

• banca del sangue
• ostetricia (gravide)
• reparti neuro-psichiatrici
• centro MST
• chirurgia durgenza
• espianto dorgano

ELISA(GM) VDRL/TPPA
VDRL/TPPA
test rapido RPR o TPPA
63
Screening per la sifilide negli utenti
asintomatici di un Centro MST
VDRL / TPPA
anamnesi
ripetere TPPA gt 15 gg
titolo VDRL
64
INTREPRETAZIONE SIEROLOGIA
65
SIERO NEONATALE

• In caso di madre con sierologia positiva
• il siero neonatale sarà positivo
• per il passaggio transplacentare
• delle IgG materne ma non per le IgM
• Gli anticorpi materni si negativizzano lt 6 mese
  test non treponemici
• 
  lt 15 mese test treponemici
• La diagnosi sierologica di sifilide neonatale si
  basa
• sulla dimostrazione delle IgM
• con FTA-abs, ELISA e Western Blot
  (golden-standard e test di conferma)
• IgM negative assenza di infezione neonatale
• positivizzazione tardiva
  per infezione gt VIII mese
• ripetere test mensilmente
  per 3 mesi o trattare
• IgM positive infezione neonatale possibile falso
  positivo
• (Fatt. Reumatoide)
• ? conferma con WB

IgG
IgM
66
VALUTAZIONE DEL LIQUOR

• pleiocitosi ? 5 cell/cc
• proteinorrachia ? 40 mg/dl
• VDRL (nel 50-70 dei casi)
• TPPA/FTA-abs
• Western Blot
• Nelle forme recenti tutti i parametri sono
  alterati
• Nelle forme tardive i test anticorpali possono
  essere lunico parametro alterato

67
INTERPRETAZIONE dei test su liquor
68
Il Treponema pallidum.. sfuggente come le
Cerastes del Sahara