Pr

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Biologie Moléculaire des Hépatites Virales
Bases Théoriques
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QCM 1 GENOME HEPATITE B

• ADN linéaire bicaténaire contenu dans une
  nucléocapside
• ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
• ADN circulaire partiellement double brin
• il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
• il existe un seul cadre de lecture ouverte
• code pour 6 protéines

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QCM 2 STRUCTURE DE LARN

• Structure en double hélice
• Le sucre contenu dans le squelette de pentoses
  et de phosphate est le desoxyribose
• Les bases azotées contenues dans lARN sont
  identiques à celles de lADN
• Dans lARN, les bases azotées sapparient 2 à 2,
  adénine avec thymine et cytosine avec guanine
• Luracile est une base contenue dans lARN

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QCM 3 PCR ET RT-PCR

• Technique qui permet de doubler la quantité
  dADN à chaque cycle
• La RT-PCR est une technique plus sensible que la
  PCR
• La préparation de lADN est plus délicate que
  celle de lARN
• Pour lARN, une étape supplémentaire est
  nécessaire à la réalisation de la technique
• Possibilité de travailler dans une seule et
  unique pièce si on décontamine le matériel à la
  javel

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QCM 4 Tm ET SONDE

• La Tm est caractéristique dune molécule dADN
  donnée
• La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine
  contenu dans lADN
• La Tm est la température à laquelle lADN est
  complètement dénaturé
• Une sonde dhybridation permet de détecter
  nimporte quel ADN
• Le choix de la sonde doit se faire en fonction
  de sa Tm et de celle des amorces

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QCM 5
SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE

• Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
• Chaque triplet de nucléotide correspond à un
  acide aminée différent
• Un codon est constitué de trois nucléotides
• Le code génétique est dit dégénéré
• La mutation de trois nucléotides est nécessaire
  pour entraîner la modification dun acide aminée
• Le séquençage dun ADN nécessite de faire une PCR

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GENOME DU VIRUS DE LHEPATITE C

• ARN linéaire simple brin de polarité positive de
  9.6 kb
• 3 régions distinctes région 5 non codante, un
  cadre de lecture ouverte unique, et la région 3
  non codante

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GENOME DU VIRUS DE LHEPATITE B

• ADN circulaire, double brin sur 2/3 de sa
  longueur
• Code pour 4 gènes
• gène S (AgHBs)
• gène C (AgHBc, AgHBe)
• gène P (ADN polymérase)
• gène X (protéine HBX)

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STRUCTURE ARN/ADN

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REPLICATION DE LADN REPRESENTATION SCHEMATIQUE
Reproduction du génome (ADNpolymérase) Possibilit
é derreur dans la reproduction apparition de
mutations
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APPLICATION AU LABORATOIRE LA PCR LA RT-PCR
PCR Virus à ADN (HBV)
UN CYCLE DE PCR
Réactifs Taq Polymerase, dNTPs, amorces
spécifiques
RT-PCR Virus à ARN (HCV)
ARN
Réactifs Reverse transcriptase, Taq Polymerase,
dNTPs, amorces spécifiques
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PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA MANIPULATION DE
LARN

• INSTABILITE DE LARN / LADN
• ? plus facilement dégradable
• Préparation de lARN étape délicate (Rnases,
  présence éventuelle dADN)
• Attention aux contaminations
• différenciation des pièces de travail (pièce
   tampon , pièce  pré-ampli , pièce
   post-ampli 
• décontamination du plan de travail et de tout
  le matériel utilisé pour manipuler à la javel

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DETECTION DES PRODUITS PCR HYBRIDATION DE SONDE
- PRINCIPE
La température de fusion Tm est la température à
laquelle 50 de lADN est dénaturé (simple brin)
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CALCUL DE LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm)
Oligonucléotide inférieur à 20 nt Tm (en C)
(AT)x2 (GC)x4 Oligonucléotide supérieur à 20
nt Tm (en C) (AT)x2 (GC)x4 x (1
(N-20)/20)
La Tm est caractéristique dune molécule dADN
donnée Pour la réalisation dune PCR, le choix
des amorces et de la (ou les) sonde(s) se fait Tm
dépendant
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SONDE HYBRIDEE
A chaque cycle, la fluorescence augmente
proportionnellement à la quantité dADN produit.
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EXPRESSION DU GENOME SYNTHESE DES PROTEINES
TRADUCTION

• Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet
  de bases ARN (codon).
• Un codon code pour un acide aminé.

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Le code génétique
Le code génétique est dit dégénéré
Un codon START (AUG) donne le signal du début de
séquence. Trois codons STOP (UAA, UAG,
UGA) stoppe la synthèse protéique
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APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage - Principe
Réalisation dune PCR avec un mélange de dNTPs et
de ddNTPs (blocage de la synthèse dADN). Chaque
ddNTP est marqué avec un fluorochrome
spécifique. Après la PCR, migration sur gel pour
séparer les brins en fonction de leur taille et
lecture de la séquence en fonction des couleurs
de la fluorescence émise
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APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage exemple
de lhépatite B
Les mutants précore Absence dAgHBe
TRP GLY Souche sauvage
1892- T-T-T-G-G-G-G-C-1901 STOP
GLY Mutant M1 1892-
T-T-T-A-G-G-G-C-1901 STOP
ASP Mutant M2 1892-
T-T-T-A-G-G-A-C-1901
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APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage exemple
de lhépatite B
La mutation YMDD sur la polymérase (position
204) résistance au traitement à la
lamivudine Y M D
D Souche sauvage -T-T-A-T-A-T-G-G-A-T
-G-A-T-G- Y I
D D Mutant YIDD -T-T-A-T-A-T-A-G-A-T
-G-A-T-G- Y V
D D Mutant YVDD
-T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-
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QCM 1 GENOME HEPATITE B

• ADN linéaire bicaténaire contenu dans une
  nucléocapside
• ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
• ADN circulaire partiellement double brin
• il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
• il existe un seul cadre de lecture ouverte
• code pour 6 protéines

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QCM 2 STRUCTURE DE LARN

• Structure en double hélice
• Dans lARN, les bases azotées sapparient 2 à 2,
  adénine avec thymine et cytosine avec guanine
• Le sucre contenu dans le squelette de pentoses
  et de phosphate est le desoxyribose
• Les bases azotées contenues dans lARN sont
  identiques à celles de lADN
• Luracile est une base contenue dans lARN

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QCM 3 PCR ET RT-PCR

• Technique qui permet de doubler la quantité
  dADN à chaque cycle
• La RT-PCR est une technique plus sensible que la
  PCR
• La préparation de lADN est plus délicate que
  celle de lARN
• Pour lARN, une étape supplémentaire est
  nécessaire à la réalisation de la technique
• Possibilité de travailler dans une seule et
  unique pièce si on décontamine le matériel à la
  javel

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QCM 4 Tm ET SONDE

• La Tm est caractéristique dune molécule dADN
  donnée
• La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine
  contenu dans lADN
• La Tm est la température à laquelle lADN est
  complètement dénaturé
• Une sonde dhybridation permet de détecter
  nimporte quel ADN
• Le choix de la sonde doit se faire en fonction
  de sa Tm et de celle des amorces

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QCM 5
SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE

• Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
• Chaque triplet de nucléotide correspond à un
  acide aminée différent
• Un codon est constitué de trois nucléotides
• Le code génétique est dit dégénéré
• La mutation de trois nucléotides est nécessaire
  pour entraîner la modification dun acide aminée
• Le séquençage dun ADN nécessite de faire une PCR

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