Sistemas de modificaci

1
Sistemas de modificación celular

• Introducción
• Genes marcadores
• Técnicas de introducción de ADN en las células
  animales en cultivo
• Transfección
• Métodos químicos
• Métodos físicos
• Establecimiento de líneas de expresión estable
• Transducción vectores virales
• Adenovirus
• Retrovirus y Lentivirus
• Métodos de introducción de proteínas

2
Manipulación del cultivo celular para la
modificación de la expresión y/o función de los
genes.

• Ácidos nucleicos
• ADN construcciones con la secuencia codificante
  del gen de interés,
• ARN puede ser codificante o regulador (RNAi o
  antisense)
• Proteínas para evaluar su función o inhibirla
  con proteínas competidoras (dominante negativo)
• Anticuerpos para neutralizar la función de una
  proteína

3
Con qué finalidad queremos introducir ADN en una
célula?

• Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a
  una sustancia tóxica)
• Caracterizar la función de la proteína de interés
• Conocer la localización subcelular de una
  proteína (proteína marcada)
• Facilitar el estudio de la regulación de la
  expresión de un gen (región reguladora de la
  expresión del gen gen marcador)
• Obtener proteína recombinante procesada
  correctamente por células de mamífero

4
Condiciones ideales de introducción del ADN

• Eficiencia máxima
• Toxicidad nula

• El método y las condiciones óptimos para cada
  tipo celular se tienen que establecer
  empíricamente

5
Estrategias de introducción de ADN

• Transfección introducción del gen exógeno por
  métodos químicos o físicos
• Vector plásmido de expresión
• Transducción o infección introducción del gen
  exógeno mediante vectores virales
• Vector material genético del virus

6
Transfección vector

• Componentes de un plásmido de expresión de
• células de mamífero
• Origen de replicación en bacterias (ColE1) para
  mantener y amplificar el ADN
• Gen de resistencia a un antibiótico (p.e.
  ampicilina) para seleccionar las bacterias que
  tienen el plásmido
• Promotor secuencia que controla la expresión del
  transgen (p.e. pRSV expresión elevada y
  constitutiva)
• Sitio de clonage multi cloning site MCS (donde
  se introduce la secuencia de ADN de interés)
• Señal de poliadenilación (finalización del ARN
  mensajero)
• Gen de resistencia a un antibiótico para la
  selección de las células que han incorporado el
  plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o
  Higromicina).

7
Vector de expresión para células de mamífero
MCS multi cloning site
Seq. de poliadenilación
Promotor
Promotor
Gen de resistencia a la neomicina (selección en
céls. mamífero)
Para amplificación y selección en bacterias
Seq. de poliadenilación
http//www.invitrogen.com
8
Genes marcadores o reporter
Codifican para proteínas de fácil detección
Permiten Controlar la eficiencia de entrada del
ADN Estudiar la regulación de la expresión de un
gen Monitorizar la localización subcelular de la
proteína
Aplicaciones Normalización de los ensayos de
expresión Seguimiento de una proteína marcada con
un gen reporter Optimización de la metodología de
introducción del ADN
9
Genes reporter más comunes

• Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)
• Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo
  del acetil-coenzima A al antibiótico
  cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con
  cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta
  por autorradiografía.

• Luciferasa (luc)
• Enzima expresado en la luciérnaga Photinus
  pyralis. Cataliza la oxidación de las
  luciferinas, reacción que emite luz. La
  producción de luz se puede medir con un
  luminómetro.

• ?-galactosidasa (?-gal or lacZ)
• Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se
  puede medir tanto en extractos celulares con un
  espectrofotómetro (aparición de producto
  coloreado) y por métodos histoquímicos con la
  aparición de un precipitado azul en las células
  que lo expresan.

10
Genes reporter más comunes

• Green fluorescent protein (GFP)
• El gen de esta proteína autofluorescente ha sido
  el gen marcador más útil para visualizar las
  células transfectadas in vivo.
• La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria.
  
• La exposición de la GFP a luz ultravioleta
  produce la emisión de una luz verde brillante en
  células vivas, sin la necesidad de añadir ningún
  sustrato o producto.
• En la actualidad se han clonado proteínas
  fluorescentes a partir de otras especies de
  medusa, anémonas y corales

Nuevas proteínas fluorescentes disponibles
AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2
HcRed1.
11
Métodos de Transfección

• Métodos químicos
• Se mezcla el ADN con moléculas cargadas
  positivamente que facilitan la entrada del ADN en
  la célula (moléculas portadoras o carrier)
• Métodos físicos
• Introducción del ADN de forma directa

12
Métodos de Transfección

• Métodos químicos
• Coprecipitación con fosfato cálcico
• DEAE-dextrano
• Lípidos catiónicos
• Polyethylenimine (PEI)
• Métodos físicos
• Electroporación
• Microinyección
• Biolistic Particle Delivery o Gene gun
• Magnetofección

13
Barreras que tiene que superar el ADN
http//www.nano-lifescience.com/research/gene-deli
very.html

• La eficiencia de transfección depende de la
  superación de varias barreras
• adsorción del complejo de transfección en la
  superfície celular y entrada del complejo en la
  célula (membrana plasmática)
• liberación del ADN del endosoma y escape a la
  degradación lisosomal
• translocación a través de la membrana nuclear y
  entrada en el núcleo

14
1. Métodos químicos

• Coprecipitación con fosfato cálcico
• precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que
  son endocitados por la célula

ADN CaCl2 Añadir Na2PO4 en tampón Precipita
dos de CaPO4 con ADN endocitosis
15
1. Métodos químicos

• DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano)
  complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se
  introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol
• Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

16
1. Métodos químicos

• Lípidos catiónicos los liposomas catiónicos se
  acomplejan con el ADN y al fusionarse con la
  membrana celular, facilitan la entrada del ADN a
  través de endosomas

Este método recibe el nombre de Lipofección
17
Protocolo de Lipofección
18
1. Métodos químicos

• Lípidos catiónicos Alta eficiencia de
  transfección y baja toxicidad en determinados
  tipos celulares

Gen marcador ?-galactosidasa
19
1. Métodos químicos

• PEI (polyethylenimine) Es un polímero catiónico
  sintético que genera complejos con el ADN. Estos
  complejos interaccionan con los proteoglicanos
  aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

20
1. Métodos químicos
Comparación entre dos métodos de transfección en
células HEK293

• PEI

Lípidos catiónicos
Gen marcador GFP (green fluorescent protein)
21
1. Métodos químicos
Comparación de la eficiencia de la lipofección
entre distintas líneas celulares
DNA transfection of various cell lines, including
CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine
Transfection Reagent
22
Factores que pueden influir en la eficiencia de
Transfección

• Presencia de antibióticos
• El complejo puede interaccionar con el
  antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando
  la toxicidad
• Presencia de suero
• El suero puede disminuir la eficiencia de
  transfección
• Aunque la ausencia de suero puede hacer el
  liposoma más tóxico para las células

23
2. Métodos físicos

• Microinyección consiste en la inyección directa
  del ADN al citoplasma o núcleo de la célula
• Biolístico (biological ballistics) implica la
  introducción de micropartículas de tungsteno u
  oro recubiertas con ADN con una pistola de helio.
• Electroporación se basa en la generación de un
  shock eléctrico corto que origina pequeños
  orificios a la membrana que permiten la entrada
  del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada
  muerte celular
• Magnetofección utiliza nanopartículas magnéticas
  para facilitar la entrada del ADN en las células

24
Microinyección

• Introducción de soluciones de macromoléculas
  mediante capilares finos de vidrio que se
  manipulan bajo un microscopio.

25
Microinyección

• Limitaciones
• Dificultad técnica (requiere personal y
  instrumentación especializados)
• Manipulación individualizada de las células
  (elevado consumo de tiempo)
• Seguimiento individual de cada célula
  microinyectada

• Aplicaciones más corrientes
• Microinyección de células adherentes en cultivo
• Generación de animales transgénicos
  (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino
  del zigoto)
• Fecundación in vitro de oocitos (inyección de
  esperma en el citoplasma del oocito)

26
Biolistic particle delivery

• Método de transfección mediante bombardeo de las
  células con micropartículas de oro o tungsteno
  recubiertas con ADN o ARN.

Helios Gene Gun - BioRad
Aplicaciones Recomendado para células
resistentes a otros métodos y especialmente para
células vegetales
27
Electroporación
Introducción de macromoléculas en las células
mediante la exposición a un pulso eléctrico de
elevada intensidad y corta duración que provoca
la apertura de poros en la membrana plasmática.

• Ventajas
• Técnica simple, reproducible y de gran eficacia
• Desventajas
• Requiere desenganchar las células del sustrato
• Mucha mortalidad celular
• Se tienen que ajustar las condiciones para cada
  tipo celular

28
Electroporación

• Parámetros
• Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm)
• Longitud del pulso (de ?seg a mseg)
• Normalmente las condiciones que permiten una
  mayor eficiencia de transfección provocan una
  muerte celular de entre el 40 y el 60
• En la actualidad existen también sistemas de
  electroporación para células adheridas al
  sustrato y para realizar electroporaciones in
  vivo.

29
MagnetofecciónMATra - Magnet Assisted
Transfection
Utilización de nanopartículas magnéticas para
mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN,
dentro de las células.
30
Tipos de transfección

• Transfección transitoria expresión de la
  proteína exógena durante un período corto (1 a 4
  días). El ADN no se integra en el genoma de la
  célula.
• Transfección estable permite la expresión de la
  proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue
  mediante la selección de los clones que hayan
  incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de
  inserción 1 célula de cada 10000).

http//www.promega.com/guides/transfxn_guide/trans
fxn.pdf
31
Transfección transitoria vs. Transfección estable
Transfección transitoria

• Ventajas
• Elevado nivel de expresión
• Es fácil co-expresar varias proteínas
• Procedimiento fácil y rápido

• Inconvenientes
• Variabilidad en el porcentaje de células
  expresoras (población celular heterogénea)
• Obtención de poca cantidad de proteína
  (producción temporal)
• Requiere gran cantidad de plásmido

Transfección estable

• Ventajas
• Población celular homogénea (clonal)
• Producción continua de proteína (teóricamente)
• Almacenamiento de células expresoras del transgen

• Inconvenientes
• Integración del transgen al azar en el genoma
  celular
• Niveles de expresión moderados
• Es complicado obtener la co-expresión de varias
  proteínas
• Procedimiento laborioso y largo de selección
  clonal

32
Clones estables procedimiento de obtención
Transfección
1/10000 céls.
2 días
Adición antibiótico
1-2 semanas
Muerte masiva células no estables
2 semanas
Se cultivan y amplifican para testar y
caracterizar la expresión del gen
Colonias de células estables
Se tripsinizan individualemente
2 meses
1 mes
33
Clones estables selección con antibiótico
Sin selección
Con selección
muerte de células no expresoras
crecimiento de los clones estables
aparición de clones resistentes

• Cassettes de resistencia
• NEO Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml)
• HYG Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml)
• PAC Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml)
• Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis
  proteica

34
Tema 9.Sistemas de modificación celular

• Introducción
• Genes marcadores
• Técnicas de introducción de ADN en las células
  animales en cultivo
• Transfección
• Métodos químicos
• Métodos físicos
• Establecimiento de líneas de expresión estable
• Transducción vectores virales
• Adenovirus
• Retrovirus y Lentivirus
• Métodos de introducción de proteínas

35
Transducción vectores virales

• Adenovirus
• Retrovirus
• Lentivirus
• Herpes virus
• Adeno-associated virus

36
Vectores virales Adenovirus

• Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej.
  resfriado común)
• Genoma ADN de doble cadena linear con una
  proteína unida covalentemente al extremo 5 (TP
  terminal protein). Longitud aprox. 36 kb
• Simetria icosahédrica (80-100 nm diámetro)
• Proteínas de la cápside Hexon, penton base,
  fibra globular

37
Vectores virales Adenovirus

• Ciclo del Adenovirus
• Entran mediante la unión (alta afinitat) a
  receptores específicos de la célula diana mediada
  por el extremo globular de la fibra
• Endocitosis del virus
• Sale del endosoma y transloca al núcleo
• El ADN viral entra en el núcleo y empieza la
  transcripción
• La transcripción, la replicación y el empaquetado
  tienen lugar dentro del núcleo de la célula
  infectada.

38
Vectores virales Adenovirus

• Genoma del Adenovirus

Se transcriben las dos cadenas de
ADN Transcripción en dos fases Early E1, E2,
E3 i E4 (antes de la replicación del ADN) Late
(después de la replicación del ADN)
39
Vectores virales Adenovirus

• Vector Adenoviral
• Virus deficientes en la replicación- deleción de
  las regiones E1 (esencial para la replicación) y
  E3 (modulación respuesta immune huésped).
• El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X)
• Empaquetado en una línea celular que proporciona
  los productos de E1 y E3 en trans (normalmente
  HEK293)

40
Vectores virales Adenovirus

• Ventajas
• Infectan un amplio rango de células de mamífero
  con elevada eficiencia
• Infectan tanto células en división como células
  que no se replican
• Elevados niveles de expresión de la proteína
• Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad
  (adecuado para terapia génica)
• El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no
  produce mutagénesis (epicromosómico)
• Se pueden utilizar en cultivos en suspensión
  (producción de proteína a gran escala)
• Sistema homólogo para genes humanos

41
Vectores virales Adenovirus

• Inconvenientes
• Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb)
• Expresión transitoria de la proteína
• Aplicaciones
• Transducción de ADN en células de mamífero para
  estudios de funcionalidad de proteínas
• Obtención de proteína recombinante por
  sobre-expresión en células humanas
• Terapia génica in vivo

42
Retrovirus
Oncoretrovirus (retrovirus) ej. Moloney
Murine Leukemia Virus Sólo infectan células en
división Lentivirus ej. HIV Infectan tanto
células en división como quiescentes
43
Vectores virales Retrovirus

• Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de
  proteína (ssRNA)
• Codifica por una transcriptasa reversa (RTase
  RNA-dependent DNA polymerase)
• Sólo infecta a células en división
• Se integra en el genoma de la célula

44
Vectores virales Retrovirus

• Ciclo del retrovirus
• Infección célula diana
• Genoma RNA ? copia DNA ? transporte al núcleo
• Integración del ADN al cromosoma
• Transcripción DNA viral ? mRNA
• Traducción mRNA ? gag, pol, env
• Formación cápside empaquetamiento de mRNAs/RTase
• Partículas virales liberadas

45
Vectores virales Retrovirus

• Construcción Vector Retroviral
• Qué es imprescindible?
• 5 LTR (promotor) y 3 LTR (polyA)
• señal de empaquetamiento
• No se necesita
• gag, pol, env
• estas proteínas las puede proporcionar la línia
  celular utilizada
• para la producción de los viriones

46
Vectores virales Retrovirus
Construcción Vector Retroviral
47
Vectores virales Retrovirus

• Obtención de los Retrovirus

Producción de los retrovirus
Línea celular empaquetadora
48
Vectores virales Retrovirus

• Ventajas
• Expresión estable de la proteína (integración del
  ADN al genoma)
• Puede infectar células de distintas especies
  (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos)
• Inconvenientes
• Limitación tamaño inserto ( 8 kb)
• Dificultad de producción a gran escala de los
  retrovirus
• No infecta células que no se repliquen
• La inserción del ADN al genoma puede producir
  mutagénesis insercional
• Aplicaciones
• Introducción de ADN en células en cultivo para
  obtener expresión estable
• Terapia génica ex vivo

49
Lentivirus
50
(No Transcript)
51
(No Transcript)
52
Métodos de transfección de péptidos, proteínas o
anticuerpos

• Microinyección
• Electroporación
• Lípidos catiónicos
• BioPorter (Genlantis)
• Pro-Ject (Pierce)
• Carriers de composición desconocida
• Chariot? (Active Motif)
• ProteoJuice ? (Novagen)
• TransPass P (New England Biolabs)
• BioTrek Protein Delivery Reagent (Stratagene)

53
Aplicaciones

• Estudiar la función de la proteína introducida
• Inhibir la actividad de una proteína celular
  endógena
• Analizar la distribución subcelular de la
  proteína introducida
• Realizar inmunodetección de proteínas en células
  vivas

54
BioPORTER? Reagent
www.genetherapysystems.com
55
Pro-Ject Protein Transfection Reagent
Efficient protein delivery in hours instead of
days. This is a unique cationic lipid mixture
which, when complexed with proteins or peptides,
allows direct intracellular delivery of proteins,
peptides, antibodies and other biologically
active molecules. Pro-Ject Protein Complexes
attach to negatively charged cell surfaces and
either can directly fuse with the membrane and
deliver the captured protein into the cell or be
endocytosed by the cell and then fuse with the
endosome, releasing the captured protein into the
cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is
noncovalent it does not interfere with the
protein's biological activity.
http//www.piercenet.com/
56

• Chariot
• simple, efficient protein delivery
• Chariot is a revolutionary delivery reagent
  that quickly and efficiently transports
  biologically active proteins, peptides and
  antibodies directly into cells. The typical
  delivery efficiency is 60-95. Less than two
  hours after delivery, live cells can be assayed
  to determine the effects of the introduced
  material, without the need for fixing. This makes
  Chariot an ideal tool for functional studies,
  including delivering inhibitory proteins,
  labeling organelles, screening peptide libraries
  and studying protein half-lives transient
  complementation.
• The Chariot Advantage
• Works in a variety of cell lines
• Facilitates functional studies in living cells
  no fixing required
• Works in vivo (1)
• Fast and efficient 60-95 transfection in less
  than 2 hours
• No need for expression of fusion proteins
• Non-cytotoxic, serum independent