Pr

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• Chapitre 6 Techniques de purification des
  protéines
• Isolement des protéines
• A. Choix dune source de protéines
• B. Techniques de solubilisation
• C. Stabilisation des protéines
• D. Détection des protéines
• E. Stratégie générale de purification de protéines

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2. Solubilité des protéines A. Influence de la
concentration en sels B. Influence du pH 3.
Separation par chromatographie A. Chromatographie
par échange dions B. Chromatographie par
filtration sur gel C. Chromatographie
daffinité D. Autres techniques chromatographiques
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4. Electrophorèse A. SDS-PAGE B. Focalisation
isoélectrique 5. Ultracentrifugation A.
Ultracentrifugation préparative
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Purification des protéines
Pourquoi purifier ? Etudier les propriétés dune
protéine Déterminer sa séquence en acides
aminés Déterminer sa structure tridimensionnelle
Difficulté Les cellules contiennent généralement
plus de 1000 types de protéines différentes.
Chaque protéine a donc en moyenne une abondance
inférieure à 1/1000 Solution Tirer profit des
différences de propriétés physicochimiques et
biochimiques des protéines solubilité, taille,
point isoélectrique, charge, hydrophobicité,
affinité pour certains ligands
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Ces techniques sont des outils de base de la
biochimie et et beaucoup de ces techniques sont
utilisées en routine pour des applications
cliniques
1 ISOLEMENT DES PROTEINES Certaines protéines
représentent la substance principale dune
cellule, par exemple lhémoglobine dans les
globules rouges. Dautres protéines, comme le
répresseur de lopéron lactose dE. coli, se
trouvent quà raison de quelques molécules par
cellule. Les mêmes techniques sont utilisées pour
purifier ces deux protéines. Leur isolement et
leur purification représentent souvent des jours
de travail pour obtenir quelques milligrams (mg)
ou micrograms (?g) de la protéine désirée
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• A. Choix dune source de protéines
• Les protéines qui assurent des fonctions
  identiques se retrouvent en général chez de
  nombreux organismes, par exemple les enzymes de
  la glycolyse
• Mais, on peut trouver différentes variantes dune
  même protéine dans différents tissus du même
  organisme ou dans différents compartiments de la
  même cellule, par exemple des isozymes
• Le choix doit tenir compte de critères tels que
  possibilité de se procurer facilement des
  quantités suffisantes du tissu dou on veut
  isoler la protéine
• On utilise souvent des tissus danimaux tels que
  poulets, boeufs, porcs ou rats. On peut également
  partir de microorganismes comme E. coli ou la
  levure

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A. Choix dune source de protéines.... Par
clonage moléculaire, pratiquement nimporte quel
gène codant une protéine peut être isolé de son
organisme dorigine et exprimé en grande quantité
(surexprimé) dans un organisme approprié mis en
culture tel que E. coli ou la levure La protéine
ainsi clonée et surexprimé peut représenter
jusquà 30 des protéines totales de la cellule
surproductrice Ceci facilite beaucoup
lisolement et purification de la protéine clonée

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B. Techniques de solubilisation
La méthode de lyse la plus simple appelé lyse
osmotique, consiste à mettre les cellules dans un
milieu hypotonique. Pour faciliter la rupture de
cellules, on ajoute souvent un détergent non
ionique comme le Triton ou le Tween Cette
technique est sans effet avec les cellules qui
ont une paroi cellulaire. Le lysozyme peut être
utilisé pour digérer les parois bactériennes
Dans beaucoup de cas, un traitement mécanique
est nécessaire broyage en présence de sable,
lutilisation dun homogénéiseur, dune Presse de
French ou dun sonicateur. Le lysat obtenu est
ensuite centrifugé
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Centrifugation différentielle
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C. Stabilisation des protéines Les protéines
sont facilement dénaturées à haute température et
se dénaturent lentement à 25C. La purification
de protéines se fait normalement à 4C Les
cellules contiennent des protéases quon peut
inactiver ou inhiber par des agents chimiques
spécifiques Dautres précautions éviter
loxydation de résidus cystéines éviter la
contamination par des métaux lourds garder la
concentration saline dans la zone de stabilité de
la protéine empêcher la croissance des
micro-organismes éviter de faire mousser et
garder une solution protéique sous forme
concentrée
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D. Détection des protéines Lorsquon purifie une
protéine, on doit pouvoir la mesurer
quantitativement et spécifiquement. En
conséquence, on doit disposer dune méthode de
dosage spécifique
a. Les dosages de protéines les plus simples
sappliquent aux enzymes - dosage
spectrophotométrique, fluorométrique ou
radiochimique
b. On peut détecter des protéines autres que des
enzymes en tirant parti de leur propriété de se
lier à des molécules spécifiques (ligands) par
exemple des récepteurs
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c. Les techniques immunochimiques sont très
sensible et spécifiques. Ces méthodes utilisent
des anticorps produites par le système
immunitaire dun animal en réponse à linjection
dune protéine étrangère (anticorps polyclonaux)
On peut également obtenir des anticorps
monoclonaux en fusionnant une cellule produisant
lanticorps avec une cellule dun cancer du
système immunitaire appelé myélome
On détecte la protéine directement en la faisant
précipiter avec ces anticorps ou indirectement
par dosage immunoenzymatique appelé ELISA
(enzyme-linked immunoabsorbent assay)
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Test immunoenzymatique (ELISA)
Substrate
Echantillon contenant différents antigens
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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• 2 SOLUBILITE DES PROTEINES
• A. Influence de la concentration en sels
• La solubilité dune protéine à faible force
  ionique augmente généralement avec la
  concentration en sel, appelé salting in
  (solubilisation saline) Pour des forces ioniques
  élevées, la solubilité des protéines diminue,
  appelé salting out (précipitation saline)

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(No Transcript)
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B. Influence du pH
La solubilité dune protéine est au minimum
quand pH pI. Cette propriété est lorigine
dune méthode de purification des protéines
appelé précipitation isoélectrique
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(No Transcript)
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• 3 SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE
• La solution de protéines dissout dans la phase
  mobile est filtrée à travers dune colonne
  constituée dun support solide poreux la phase
  stationnaire
• Les interactions des différentes protéines avec
  la phase stationnaire ralentissent plus ou moins
  leur migration à travers le support
• Si la force de rétention est de nature ionique,
  la technique de séparation est appelée
  chromatographie par échange dions

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(No Transcript)
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Chromatographie sur échangeurs danions
Principe une protéine a - une charge positive
aux pH lt pI - une charge négative aux pH gt
pI Elle peut donc être retenue sur un échangeur
de cations ou un échangeur danions, suivant le
cas Elle peut alors être éluée par passage dun
tampon contenant du sel en quantités
croissantes Echangeur danions gel porteur de
charges fixes positives Echangeur de cations
gel porteur de charges fixes négatives
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Chromatographie déchanges dions avec élution
par paliers
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Dispositif pour créer un gradient de
concentration linéaire
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B. Chromatographie par filtration sur gel Dans
la chromatographie par filtration sur gel,
appelée également chromatographie par exclusion
ou par tamisage moléculaire, les protéines sont
séparées selon leur taille et leur forme
a. La plupart des gels sont constitués de dextran
(Sephadex), dagarose ou de polyacrylamide
La filtration sur gel est souvent utilisée pour
dessaler une solution protéique. Ainsi, on
peut éliminer le sulfate dammonium dune
protéine qui a été précipitée par ce sel
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Chromatographie par filtration sur gel
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b. La chromatographie par filtration sur gel peut
servir à estimer les masses moléculaires
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c. La dialyse est une forme de filtration
moléculaire La dialyse permet de séparer les
molécules selon leur taille, en utilisant des
membranes semiperméables dont les pores ont une
taille inférieure aux macromolécules
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C. Chromatographie daffinité Dans la
chromatographie daffinité, un ligand qui se lie
spécifiquement à la protéine est fixé par
covalence à une matrice inerte et poreuse
Quand une solution protéique traverse ce
matériel, la protéine dintérêt se lie au ligand
immobilisé, tandis que les autres sortent de la
colonne. On peut récupérer la protéine désirée
sous forme très pure en modifiant les conditions
délution de sorte que la protéine se détache de
la matrice chromatographique
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Chromatographie daffinité
Principe Repose sur la relative spécificité
dinteraction dune protéine pour certains
ligands Exemple affinité de lhexokinase pour
lATP La protéine sadsorbe sur un gel sur
lequel le ligand est fixé de façon
covalente Elle est ensuite éluée en lavant avec
un milieu contenant du ligand non fixé (ou en
augmentant la concentration en sels, ou en
changeant le pH)
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(No Transcript)
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Purification de la nucléase de staphylocoque par
chromatographie daffinité -le compose représenté
en (b) a été lie par covalence à de lagarose
activé par le CNBr
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• D. Autres techniques chromatographiques
• a. La chromatographie en phase inverse (RPC)
• Dans les protéines dénaturées, les chaînes
  latérales non polaires se trouvent exposées au
  solvant. Par conséquent, les protéines
  établissent des interactions hydrophobes avec les
  groupes non polaires fixés sur une matrice
• Les protéines sont éluées par une phase mobile
  contenant une forte concentration de solvant
  organique tel que lacétonitrile
• Dans la chromatographie liquide à haute
  performance (HPLC) en phase inverse, des chaînes
  paraffiniques sont fixées sur des billes de
  silice

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b. La chromatographie par interactions
hydrophobes sépare les protéines natives en vertu
de lhydrophobicité de surface
Principe Les protéines présentent des
affinités variables pour les groupements
hydrophobes Elles se lient donc avec une
affinité variable à un gel porteur de groupements
hydrophobes Elles peuvent en être éluées, soit
en diminuant la concentration de sels, soit en
augmentant la concentration dun solvant moins
polaire que leau (éthylène glycol)
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4 ELECTROPHORESE

• Séparation de solutés chargés par migration dans
  un champ électrique
• - la migration dépend
• de la charge de la protéine
• de sa taille
• du support (gel plus ou moins réticulé, papier)
• dans la focalisation isoélectrique
  (électrophorèse dans gradient de pH)
• migration dépend uniquement du pI
• dans lélectrophorèse SDS-PAGE, la vitesse de
  migration dépend
• de la taille de sous-unité (protéine dénaturée)
• - du degré de réticulation du gel
• Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
  electrophoresis

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• A. SDS-PAGE
• Le SDS se lie très fortement aux protéines en
  leur conférant une forme de bâtonnet. Les
  protéines lient environ une molécule de SDS pour
  deux résidus dacides aminés
• La forte charge négative apportée par le SDS
  masque la charge intrinsèque de la protéine, bien
  que le rapport e/m reste identique. Par
  conséquent, lélectrophorèse de protéines en gel
  de polyacrylamide contenant du SDS les sépare en
  fonction de leur masse moléculaire, par effect de
  filtration sur gel SDS-PAGE

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(No Transcript)
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SDS-PAGE
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(No Transcript)
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Relation logarithmique entre la masse moléculaire
dune protéine et sa mobilité électrophorétique
relative en SDS-PAGE
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Western blot immunoempreinte
Révélation dune protéine à laide dun anticorps
spécifique
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• B. Focalisation isoélectrique
• Si un mélange de protéines est soumis à une
  électrophorèse dans une matrice ayant un gradient
  de pH et dont le pH augmente lentement de lanode
  vers la cathode, chaque protéine va migrer
  jusquà lendroit où le pH est égal à son point
  isoélectrique

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Electrophorèse sur gel en deux dimensions
(électrophorèse 2D)
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Le gradient de pH est obtenu en mélangeant des
oligomères de faible mass (300-600 Da) qui
portent des groupes amino et carboxyliques
aliphatiques (ampholytes) formant ainsi un
éventail de points isoélectriques
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5 ULTRACENTRIFUGATION Lultracentrifugeuse, mis
au point par The Svedberg en 1923, peut atteindre
des vitesses de rotation de 80000 rpm et permet
la sédimentation de macromolécules. La masse
dune particule peut être calculée à partir de
son coefficient de sédimentation, analogue à la
mobilité électrophorétique, en unités Svedberg (S)
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• A. Ultracentrifugation préparative
• Dans l'ultracentrifugation zonale, une suspension
  protéique est soigneusement déposée au-dessus
  d'un gradient de densité de saccharose. Au cours
  de la centrifugation, chaque particule traverse
  le gradient en fonction de son coefficient de
  sédimentation

Ultracentrifugation zonale -utilisé pour des
complexes macromoléculaires, des particules et
des fractions membranaires