UE Sp

1
UE Spécifique

• ANALYSE ET METHODES D ETUDE
• DU GENOME

2
I- STRUCTURE DU GENOME

• Organisation
• Composition
• Les différentes séquences
• Le gène

3
INTRODUCTION

• Ensemble du matériel génétique dun organisme
• Il est constitué dADN pour la majorité des
  organismes
• Certains virus ont un génome constitué
• dARN
• La taille du génome varie en fonction des espèces

4
ORGANISATION

• Chez la majorité des bactéries ( procaryotes) le
  génome est contenu dans UN seul chromosome
  circulaire
• Le génome peut être linéaire (actinomycètes)
• Chez les eucaryotes ADN nucléaire , ADN
  mitochondrial

5
DENSITE DES GENOMES

• Chez E.Coli , le génome est composé presque
  exclusivement de gènes
• 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb
• Chez lHomme
• 3200 Mégabases / 25000 Gènes / 8 / MGB
• La quasi-totalité génome bactérien est codant !

6
Espèce Humaine

• Génome nucléaire 3,2 109 pb pour n chromosomes
  et répartis dans 22 autosomes 2 chromosomes
  sexuels
• Génome mitochondrial 16 559 pb, épisome
• Aucune corrélation entre la taille du génome et
  la complexité des organismes
• Plus grands génomes gt 150 109 pb pins,
  plantes

7
COMPOSITION DU GENOME HUMAIN

• Des gènes environ 25 000 composés de
  séquences codantes ( exons) et non codantes (les
  introns, séquences régulatrices promoteur,
  silencer, enhancer )
• régions codantes 1.5 du génome
• introns 25, région régulatrices 5
• Des Pseudogènes 1.5
• De très nombreuses séquences répétèes 60
• Autres régions non codantes séquences uniques
  
• ou très peu répétées 7

8
Séquences répétées

• Répétées en Tandem
• minisatellites  des séquences de 10 à 25 pb sont
  répétées un grand nombre de fois
• ( empreintes génétiques)
• microsatellites  1à 5 pb répétées x fois sur
  plusieurs kb
• ADN satellite centromères , télomères ( 10 du
  génome humain)

9
Microsatellites

• Dispersés sur tout le génome
• 1 à 5 nucléotides
• Copies
• A(n) / T(n) 107
• (CG)n / (CA)n/ (GT)n 7 ? 106
• (CT)n / (GA)n 3 x 106

Les plus étudiés (CG CA)n
CG
n 23
n 15
n 20
CGCGCGCG ? TANDEM
10

• Séquences répétées dispersées
• Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu)
• Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb
• Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases
• ( 400 000 copies)
• Les transposons ( 300 000 copies)

11
Séquences répétés dispersées

• SINEs Famille ALU

Copies 7 ? 105
250-400 pb
250-400 pb
104 pb
ALU
ALU
Famille Kpn (L1) 1300 pb copies 6 ? 104
Peuvent être transcrites
12
Séquences SINEs

• ALU REPEAT

120
135
290
(AAA)n
AT RICH
GC RICH
GC RICH
(AAA)n
13
Eléments transposables

• IS éléments

2600 700 pb
5' ? 3' CTGACTT
3' ? 5' TTCAGTC
Répétition aux extrêmités (Maïs)
14
Gène

• Séquence d'acides nucléiques contenant une
  information codée, transmissible, pour la
  production régulée d'un ARN (transcription), ce
  dernier pouvant être traduit en une chaîne
  polypeptique
• Certains gènes codent seulement des ARN sans
  traduction en protéine

15
Les gènes des rétrovirus sont constitués d'ARN
16
Pseudogènes

• Séquences partiellement homologues aux gènes qui
  ne donnent jamais de protéines correspondantes
• ? Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté
• ? Soit des ARN ? retro-transcrit ? ADN ?
  intégration ADN génomique ( transposition)

17

• ANATOMIE DU GENE b globine

18
Zone des promoteurs
5' UTR
3' UTR
31
30
104
105
146
1

Exon III
IVS2
Exon I
Exon II
IVS1
Gène b globine
1600 pb
19
Région régulatrice en 5'Zone des promoteurs
Facteurs de transcription
-105
-100
-70
-80
-30 -25
CAP
CACCC
CACCC
CCAAT
TATA A/T A A/T
A G
Site d'initiation de la transcription
G CCCCC
20
Région 5' non Traduite5' UTR
CAP
Codon initiateur
8 - 13 30......
CACCATG
50
0
CTTCTG
Région 5' UTR - Attachement aux ribosomes
- Régulation transcription /-
21
Exon

• Partie codante d'un gène ? protéine

ATG
IVS1
Exon 1
30
Exons ? Traduction ? protéine
22
IVS1 130 pb
Exon 2
Zone non traduite
GT Donneur de l'épissage
AG Accepteur de l'épissage
23
Région 3' UTR
Codon 147
146
AATAAA
STOP
20
AAAAAA
132 Nucléotides
AATAAA Signal de polyadénylation
Clivage de l'ARN après
transcription (AAAAA)n Stabilise l'ARN (
ajouté après la transcription)
24
II ETUDE DU GENOME

• A- Les expériences fondamentales
  qui ont révélé l existence de lADN comme Génome
  
• L Etude du génome complet dun individu est
  très récente et découle du séquençage dun
  génome entier ( début XXI)

25

• Cest lanalyse de lADN
• Elle était indirecte avant linvention des
  techniques du séquençage (1977)
• Elle utilisait létude des protéines qui
  renseignaient indirectement sur les gènes
• Des mutants de bactéries , de drosophiles

26
Origines de létude du Génome

• Dès le XIX siècle létude de la transmission
  des caractères sur des critères danalyses
  qualitatives et statistiques
• ( Lois de Mendel 1860)
• Mise en évidence de l ADN (1865)
• Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile)
  critères danalyses qualitatives et statistiques
• Puis des techniques bactériologiques et
  biochimiques ont permis de franchir une étape
  dans le degré dinvestigation de létude des
  génomes ( 1920-1952)
• Structure ADN (1953 )

27
Expérience de Griffith (1928)

• Bactérie Diplococcus pneumoniae
• 2 souches
• S capsule polysaccharidique
• gt infectieux
• R dépourvue de capsule
• gt non infectieux

28
Des lots de souris

• Groupe1 Injection souche S à des souris gt
  pneumonie
• Groupe 2 Injection souche R gt pas dinfection
• Groupe 3 Injection dune souche R souche S
  préalablement tuée par la chaleur
• gt pneumonie

29
RESULTAT

• Le sang des souris du groupe 3 est mis en culture
  on recueille soit des souches R soit des
  souches S virulentes ...
• Lexpérience fût refaite en 1944 avec la
  conclusion que lADN était le matériel héréditaire

30
Avery, Mac Leod, Mac Carthy

• Interprétation Les souches S tuées sont
  capables dinduire une transformation des
  bactéries R en bactéries S
• Quelle est la nature de ce matériel transmissible
  ?
• En ajoutant l ADN purifié des souches S à des
  colonies de type R les colonies R gt S
• Les autres fractions (polysaccharides,protéines)
  nont pas de pouvoir transformant...

31

• Lorsque lADN des souches S est traité par la
  DNAse avant dêtre ajouté aux bactéries de souche
  R gt pas de bactérie de type S
• La transformation des souches R en souche S est
  la conséquence dun transfert dADN
• LADN est donc le matériel génétique

32
(No Transcript)
33

• De 1944 à 1952 une partie de la
  communauté scientifique nétait toujours pas
  convaincue par cette conclusion et lhypothèse
  que les protéines étaient le matériel héréditaire
  était encore défendue

34

• Colette VENDRELY ( professeur dembryologie à
  Amiens ) R. VENDRELY démontrent en 1949 que la
  quantité dADN présente dans les gamètes est la
  moitié de celle contenue dans les cellules
  somatiques.
• Ce résultat est le seul travail français
  internationalement cité comme contribution
  majeure à la preuve de lADN comme matériel
  héréditaire

35
UN pas décisif vers la découverte de la structure
de l ADN

• En 1950 Erwin Chargaff découvre que
  l'adénine et la thymine existent en quantités
  égales, et qu'il en est de même de la guanine et
  de la cytosine, d'où la célèbre équation
• A T
• G C

36
Expérience Hershey Chase

• 1952, ils démontrent en utilisant le phage T2
  traité au tritium (acides nucléiques
  radio-actifs) que les ADNs répliqués sont
  radioactifs.
• Les protéines ne sont pas radioactives donc ne se
  répliquent pas

37
Découverte de la structure de lADN 1953
38
(No Transcript)
39
Découverte de la structure de lADN
40
(No Transcript)
41
It has not escaped our notice that the
specific pairing we have postulated immediately
suggests a possible copying mechanism for the
genetic material .

•  Il n a pas échappé à notre attention que la
  les appariements spécifiques que nous proposons
  suppose immédiatement un mécanisme de copie du
  matériel génétique  
• Le modèle de réplication semi-conservatif sera
  prouvé en 1958 par Meselson et Stalh

42
Le modèle semi conservatif de la réplication

• Le bon modèle pour 3 possibilités

43
modèle conservatif A partir d'une molécule d'ADN
bicaténaire "mère", on forme une nouvelle
molécule d'ADN bicaténaire.On garde donc ici une
molécule "mère", non modifiée (elle est donc
conservée), tout en "créant" une nouvelle
molécule ("fille").
44
On ne conserve aucun brin intact.La copie se
réalise par fragments dispersés dans l'ensemble
de l'ADN, permettant de former les deux molécules
d'ADN bicaténaires "filles".
45
Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN
bicaténaire "mère".Chaque brin sert donc de
matrice à la synthèse d'un brin complémentaire,
l'ensemble reformant une molécule d'ADN
bicaténaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne
conserve donc que la moitié de la molécule mère
46
Dans le tube 0 la totalité de lADN est marqué à
l azote 15 ( les 2 brins) . Après une
réplication la moitié de lADN est radio actif .
Au fur et à mesure des réplications la quantité
dADN marqué diminue lADN au profit dabord d
ADN hybride , puis dADN froid.
47
Le résultat observé après séparation des ADNs
répliqué correspond au modèle semi conservatif
48
Propriétés physico-chimiques

• Déroulement de tout l ADN dune cellule dun
  individu 1.6 Mètre
• Déroulement de lADN de toutes les cellules dun
  individu diamètre du système solaire!
• ADN cellulaire 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)

49
Quelques valeurs

• Pb 6 .10 9
• Masse Moléculaire 2x330 g x 6.109 /6,02.1023
  moles de nucléotides
• gt 6,6.10-12 g dADN
• Il y a environ 6 picogrammes dADN dans une
  cellule diploide
• 1 µg dADN génomique -gt 10-6 g /6.6 10-12
  g/cellule gtgt
• 107 cellules diploides

50
II ETUDE DU GENOME

• B) LES OUTILS

51
B- 1- PURIFICATION DE l ADNMéthode au Phénol /
Chloroforme

• Purification des cellules
• Lyse des cellules ( SDS, Lysozyme)
• Action protéinase K, Rnase
• Extraction au phénol
• Action du CHCl3
• Précipitation dans léthanol en milieu salin
• Re-suspension en présence de tampon TRIS - EDTA (
  1 mM) ( 100 microG / microl)

52
(No Transcript)
53
(No Transcript)
54
B-2 Les Enzymes de Restriction

• Sont des ciseaux moléculaires qui hydrolysent
  lADN Ils reconnaissent des séquences
  palindromiques (Ex RADAR)
• Ils permettent de mette en évidence des
  variations de séquence ( polymorphismes,
  mutations)
• Ils sont utilisés en génie génétique ( clonage)
• En diagnostic de routine en génétique médicale

55
Des enzymes de Restriction
56

• 5'-GGATCC-3' Bam HI
• 3'-CCTAG G-5
• 5 '-G -3' ---? 5'- GATCC-3'
• 3'-CCTAG-5' ----gt 3'- G-5'

57
(No Transcript)
58
B-3 L Hybridation et les sondes

• Hybridation par complémentarité de séquence et
  appariement des bases
• Sonde petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée
  par un composé fluorescent, ou radioactif
• Les sondes doivent être spécifiques dune
  séquence et très sensibles.
• Utilisation diagnostique

59
(No Transcript)
60
ADN hautement répétitif
100
S I M P L E B R I N
60
ADN moyennement répétitif
ADN peu répétitif
20
10-2
Copies uniques
10-3
104
101
100
102
Cot (mole ? sec .l-1)
Rapide
Lent
Taux de Renaturation
61
B-4 Application sondes et ER "POLYMORPHISME"Plu
sieurs Formes
Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle
soit ponctuelle ou qu'elle intéresse une
répétition de mini / micro satellites est un
polymorphisme si sa fréquence est ? 1 dans une
population donnée à une fréquence lt 1 mutation
(privée) Les polymorphismes sont soit -
Neutres - Avantageux - Désavantageux
62
Les Polymorphismes
L'ADN n'est pas un élément statique Il est sujet
à des modifications transmissibles Les
variations de séquence sont appelées
polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une
fréquence gt 0.01 (moins de 1
mutations) L'hétérozygotie moyenne de l'ADN
humain est d'environ 0,004 (1 base différente
toutes les 250 - 300 bases entre 2 allèles ou 2
séquences, entre 2 individus)
63
Le polymorphisme affecte toutes les régions de
l'ADN - Séquences codantes - Introns - ADN
répété (mini, microsat)
Il peut modifier - 1- Un site de restriction -
2- La longueur d'un motif répété
64
Un polymorphisme peut induire une ? longueur
détectable par enzyme de restriction
Microsatellites Minisatellites
65
Les polymorphismes du DNA servent à son analyse
66
RFLP
Un RFLP est défini par un couple Sonde /
Enzyme (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism) Sa localisation précise, sa
variabilité et sa transmission mendélienne lui
confèrent un caractère de marqueur génétique
codominant. Le couple sonde / enzyme se
caractérise par / - et correspond à un
bi-allélisme Les RFLPs sont mis en évidence par
la méthode de Southern ou PCR Pour être
informatif le RFLP doit être reconnu par une
sonde unique

67
On distingue des sites de restriction
obligatoires (toujours présents) et des sites de
restriction variables
? Polymorphisme
Mst II
1
3
4
2
5
20Kb
Chez un individu sur 100 on découvre
?

68
Exemple EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse
5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'
Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne
peut plus hydrolyser l'ADN à cet endroit.
A
B
GAGTTC CTCAAG
(A B)
69
Marqueur
Position non connue avec précision
Eco RI
Gène
4kb
Eco R1-
Gène muté ? maladie
?
M
5kb
Ces fragments peuvent être différencier par leur
taille
70
Polymorphisme de Répétition
EcoRI
EcoRI
(CA)n
Allèle A
200 pb
EcoRI
EcoRI
2(CA)n
Allèle B
300 pb
sonde
A/B
A/A
B/B
300
200
71
III- LES TECHNQIUES A - La méthode PCR

• Polymerase chain reaction

72
Avantage de la Technique

• Elle permet détudier un segment d ADN au sein
  de tout le génome si lon connaît sa séquence
• Elle permet de recopier ce segment (amplification
  des millions de fois et de le visualiser par une
  méthode électrophorétique
• Par coloration au bromure déthidium ou autre
  colorant
• Ce segment peut être par la suite traité pour
  mettre en évidence une mutation
• Pour le cloner

73
Principe

• Succession de réactions de réplication d'une
  matrice double brin d'ADN.
• Chaque réaction met en oeuvre deux amorces
  oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime
  pointent l'une vers l'autre.
• Les amorces ou primers en anglais définissent
  alors, en la bornant, la séquence à amplifier.
• Les amorces sont orientées dans le sens 5 vers
  3

74

•   Chaque produit de chaque étape de synthèse sert
  de matrices pour les étapes suivantes. Au lieu
  d'être linéaire, l'amplification obtenue est
  exponentielle.
•   Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel de
  Chimie dès 1993), la technique connaît un essor
  considérable à partir de la commercialisation
  (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux
  températures élevées (la Taq polymérase), qui
  permet une automatisation de la technique en
  supportant les sauts de température

75
On opère avec des sauts de température à chaque
étape

• EN effet, une température dite dannealing permet
  lhybridation de lamorce avec lADN
• ( 56)
• A une autre température , cest l élongation ou
  extension ( 72 C)
• A une dernière température les brins amplifiés
  sont séparés température de dénaturation
• ( 94c )

76
(No Transcript)
77

• http//www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/pre
  sentation.htm
• Ou Principe de la PCR gt ( google)
• www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm

78

• On peut ainsi amplifier assez facilement une
  région couvrant 2000 pb
• Des amplifications de morceaux plus longs sont
  possibles mais plus délicates ( 10 000 pb)

79
(No Transcript)
80
B- GAP-PCR / Application de la méthode PCR au
diagnostic de grandes délétions

• Les délétions mises en évidence par la méthode
  PCR
• Des amorces choisies pour être très éloignées
  lune de lautre lorsquil nexiste pas de
  délétion , ne permettront pas un amplification
• En cas de délétion, les amorces sont rapprochées
  et lADN amplifié signe alors une délétion.
• Dodé C, Krishnamoorthy R, Lamb J, Rochette J.
• Br J Haematol.1993 Jan83(1)105-11

81
Distance entre A4 et A9 1800 pb si les gènes
alpha 1 et alpha 2 sont présents la Région
amplifiée est de 194pb entre A4 et A1B. Si ,les
deux gènes sont délétés la distance entre A4 et
A9 est raccourcie et lamplification révèle un
fragment de 550pb.
82
C- LA PCR INVERSE ou Reverse Transcriptase PCR
( RT-PCR)

• La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les
  ARN comme matrice d'amplification de la PCR
• On isole des ARN m par purification spécifique
  de
• de ces derniers
• Ils sont ensuite  recopiés  en ADN par une
  enzyme la transcriptase reverse
• On réalise une PCR comme précédemment
• Le produit final est un ADN dont l'un des brins
  est complémentaire de l'ARN d'intérêt et l'autre
  brin a la même séquence que cet ARN d'intérêt (à
  la substitution près de U par T).

83
(No Transcript)
84
Difficultés Techniques

• La contamination des échantillons par de l'ADN
  génomique est une des principales difficulté de
  cette technique. En effet, l'ADN génomique peut
  entrer en compétition avec l'ADNc pour lors de
  l'étape d'hybridation des amorces. Diverses
  parades sont alors utilisées

85
Parades

• 1 Des ARNm eucaryotes polyadénylés peuvent être
  purifiés par chromatographie de l'ARN cellulaire
  total sur une colonne où sont immobilisés des
  oligo-dT (oligonucléotides constitués de
  désoxythymidines).

86

• 2 Les ADN présents dans l'échantillon peuvent
  être détruits par ajout d'une activité
  désoxyribonucléase (dépourvue d'activité
  ribonucléase).

87

• 3 Choisir les amorces aux bornes d'un intron.
  Ainsi, les produits d'amplification issus de
  l'ADNc et ceux issus d'ADN génomique contaminant
  seront distingués selon leur taille les
  fragments issus de l'ADN génomique (contenant
  l'intron) auront une taille supérieure aux
  fragments d'amplification issus de l'ADNc (ne
  contenant pas l'intron).

88
D- MUTAGENESE DIRIGEE

• Réalisation dune amorce mutée
• l'extrémité 3' doit rester complémentaire de la
  séquence de matrice à amplifier (initiation de la
  polymérisation) l'extrémité 5' qui peut porter
  de nombreuses modifications des mutations
  ponctuelles, des sites de restriction, des
  séquences de recombinaison etc.

89
(No Transcript)
90
Mutation à des extrémités
91
(No Transcript)
92
Principe

• Les amorces 1 et 2 sont des amorces mutées (la
  région 5' qui porte la mutation est symbolisée
  par un rectangle rouge). Obtenues par synthèse
  chimique .Ces amorces sont complémentaires (le
  recouvrement des régions 5' mutées en rouge est
  particulièrement important pour la suite). Les
  amorces 3 et 4 bornent le segment d'ADN à
  modifier. Elles détermineront la longueur du
  produit final.

93

• Deux réactions de PCR sont effectuées en
  parallèle Une PCR avec les amorces 2 et 3
  donne un produit d'amplification correctement
  muté dans la région désirée, mais de petite
  taille

94
(No Transcript)
95

• Une PCR avec les amorces 1 et 4 donne aussi un
  produit muté, mais toujours de taille
  insuffisante.

96

• Les deux produits de PCR sont purifiés , il
  s'agit surtout d'éliminer les amorces 1 et 2
• On regroupe dans le même tube tous les produits
  PCR

97

• Ils possèdent en commun la région mutée (région
  d'ADN possédant un rectangle rouge).
  L'hybridation de ces deux fragments par cette
  partie commune est critique pour la dernière
  étape.

98

• Une dernière PCR utilisant les amorces 3 et 4 est
  alors réalisée sur ce mélange et donne, en effet,
  un fragment de la taille souhaitée contenant la
  mutation.  

99
(No Transcript)
100
IV LE SEQUENCAGE

• ADN
• ARN

101
Séquençage de lADN . F SANGER (1977)
102
Séquençage de lADN Walter GILBERT
103
LE SEQUENCAGE PAR LA METHODE DE SANGER

•  
• On copie le brin à séquencer de telle sorte que
  les copies soient radioactives (ou repérables par
  un autre marquage fluorescence ) 
• Soit la séquence suivante à déterminer
• 3 G C A T G A T C G G 5
• Amorce présentera une extrémité 3 OH libre
  
• Il faut choisir une amorce complémentaire dun
  bout de séquence connue
•  
•  

104
(No Transcript)
105

• La DNA polymérase réplique 5' ?3' à partir 3'OH
  libre de lamorce
• en présence d'un 2, 3 didéoxynucléotide la
  réplication est stoppée. 
• Statistiquement on observera des fragments d'ADN
  de tailles différentes en fonction de
  l'incorporation du 2, 3 didéoxynucléotide pendant
  la réplication du brin à séquencer

106

• Tube 1
• 4dNTP, ddGTP
• 3' GCATGATCGG
• CG
• CGTACTAG
• Tube 2
• 4dNTP, ddATP
• 3'GCATGATCGG
• CGTA
• CGTACTA
•  

107

• Tube 3
• 4dNTP, ddCTP
• 3' GCATGATCGG 5'
• ddC
• CGTAC
• CGTACTAGC
• CGTACTAGCC
• Tube 4
• 4dNTP, ddTTP
• 3' GCATGATCGG 5'
• CGT
• CGTACT

108

Tube 1 ddGTP 1er fragment 2 bases 2nd
fragment 8 bases Tube 2 ddATP 1er fragment
4 bases 2nd fragment 7 bases Tube 3
ddCTP 1er fragment 1 base 2nd fragment 5
bases 3ème fragment 9 bases 4ème fragment 10
bases Tube 4 ddTTP 1er fragment 3 bases 2nd
fragment 6 bases
109

• Remarques
• Il n'y a jamais deux fois la même taille quelque
  soit le tube examiné
• Les produits sont radioactifs, ils vont être
  repérés par autoradiographie après électrophorèse
  en gel d'acrylamide.
• Les fragments migreront d'autant plus vite que
  leur masse moléculaire est faible.
• La lecture se fera de 5 vers 3 en commençant
  par les fragments les plus petits ( du bas vers
  le haut)

110

• On lit donc
• Lecture 5' CGTACTAGCC 3'
• Séquence 3' GCATGATCGG 5
• On donne le produit complémentaire du produit de
  lecture
• 3 G C A T G A T C G G 5

111
(No Transcript)
112
Sanger Centre-Cambridge
113
Sequençage direct de lARN

• ON ne transforme pas en cDNA
• Des séquences de poly T sont bloquées sur un
  support
• Le support capture les ARN par leur extrémité
  poly A
• 3dA 3 Desoxy A bloque la fin de séquence
  dARN
• Il sont ensuite complétés avec addition de
  Thymidine non marquée
• Puis bloqués avec des nucléotides fluorescents A
  et C et G , dit terminateurs Polymérase.
• Cette méthode permet le début dune lecture par
  fluorescence là où commence le RNA et ne lit pas
  le poly A .

114
(No Transcript)
115
(No Transcript)
116
V- ANALYSE DE lADN Par les méthodes de
séparation de fragments
117
La Séparation des fragments dacides nucléiques
V-A Techniques Electrophorétiques Les
macromolécules chargées électriquement peuvent
migrer dans un champ électrique. La densité de
charge par unité de longueur est la même dans
lARN et lADN (contrairement aux protéines). La
migration seffectue du Pôle - vers le Pôle du
générateur. La différence de migration se fera
donc par la taille Le support de migration (
acrylamide, agarose) jouant un rôle de filtre,
les fragments les plus petits migreront plus
rapidement que dautres plus longs dans le
dispositif classique.

118
(No Transcript)
119
Coloration au Bromure déthidium sous lampe UV
120
La migration seffectue du haut vers bas . Les
fragments les plus petits sont en bas du gel de
migration
121
(No Transcript)
122
Électrophorèse dADN humain sans hydrolyse par ER
Smear
123
V-B LA METHODE DE SOUTHERN

• http//www.univrouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/sou
  thernblot.html

124
SOUTHERN BLOT

• 1) Extraction de l'ADN des différents génotypes à
  analyser
• 2) Digestion de l'ADN par un enzyme de
  restriction. On obtient alors des fragments d'ADN
  de longueurs différentes selon les individus.
  Cette différence de taille est due a une
  différence du nombre de site de restriction qui
  varie selon les individus. l'ADN à analyser est
  fragmenté en séquences plus ou moins longues en
  fonction du polymorphisme de longueur des
  fragments de restriction.

125

• 3) Ces fragments de restriction sont séparés
  selon leur taille par une électrophorèse en gel
  d'agarose. L'ADN étant chargé négativement, il
  migre de la cathode vers l'anode. Les fragments
  les plus petits sont les plus rapides.
• 4) LE BLOT / L'ADN est ensuite transféré sous
  forme dénaturée ( NAOH, KOH, 1M) sur une membrane
  de nylon. La position relative des fragments
  d'ADN est préservée durant le transfert.

126

• 5 ) L HYBRIDATION
• La membrane est incubée dans une solution
  contenant une sonde marquée préalablement, soit
  par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde
  s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN
  avec lesquels elle présente une homologie.
• On utilise couramment deux types de sondes
• les sondes génomiques (ADNg)
• et les sondes d'ADN complémentaire (ADNc).
  

127

• Les sondes génomiques sont obtenues par digestion
  de l'ADN total du génome nucléaire de l'espèce
  étudiée à l'aide d'un enzyme de restriction. Les
  sondes d'ADNc correspondent nécessairement à des
  gènes exprimés, puisqu'elles sont obtenues à
  partir des ARN messagers.

128

• 6) L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est
  fixée sont révélés en plaçant la membrane au
  contact d'un film sensible à la radioactivité
  (figure), ou en réalisant une réaction
  enzymatique colorée spécifique..

129
4.2Kb
4kb
2Kb
130
Interprétation des résultats considérant 2
allèles
Sites Eco R1
4Kb
2Kb
Sonde
4.2kb
Site polymorphe sur le 2 ième allèle
131
Interprétation du résultat

• Des individus sont 4/2 // 4/ 2 (homozygotes)
• Des Individus ne montrent aucune hybridation
• --? Délétion dau moins 6 kb (homozygote)
• Le dernier 4/2 // 4.2/2 ses deux allèles sont
  différents ( hétérozygote)

132
(No Transcript)
133
Diagnostic de la drépanocytose

• Maladie génétique fréquente en Afrique noire au
  Moyen Orient et en Inde . Maladie récessive
• Mutation ponctuelle par substitution Glu gt Val
  sur le gène beta globine ( codon 6)
• GAG gt GTG
• Cette mutation supprime un site de restriction
  pour lenzyme Mst II

134
(No Transcript)
135
(No Transcript)
136
LE NORTHERN BLOT

• // Southern BLOT
• Isolement de lARN colonne oligo dT
• Electrophorèse sans dénaturation , sans hydrolyse
  
• Hybridation avec une sonde monobrin

137
LA GENOMIQUE

• Science des Génomes
• La génomique regroupe un ensemble d'analyses qui
  vont
• - dune cartographie physique de lADN
• - d une cartographie des ARN messagers
• - à l'identification de gènes , de
• polymorphismes et de séquences dintérêts
• - à l'étude de leurs fonctions

138
Parler de brin sens ou antisens sur l'ADN n'a de
sens (humour) que si nous nous plaçons dans le
contexte de la transcription.Le brin sens est
celui qui a la même séquence nucléotidique que
l'ARN messager transcrit (T / U mis a part bien
sûr). Le brin antisens sert de matrice à la
polymerase.L'ARN est polymerisé de 5' vers
3'.La matrice (brin "antisens") peut donc être
représenté du 3' au 5'Le brin complémentaire
(brin "sens") est donc représenté du 5' au
3'.sens 5 -ATTTGCTGCCTT...
TGC-3'antisens 3'-TAAACGACGGAA.. ACG-5'RNA
messager 5'-AUUUGCUGCCUU..UGC-3 La lecture
dune séquence par la méthode de Sanger lit (en
commençant par la talile la plus petite ) de 5
vers 3 cest à dire le brin sens
139
Cartographie de lexpression des GENES

• Hybridation de lARN sur puces à ADN

140
Analyse totale du génome par utilisation de
lexpression différentielle des gènes
On construit des supports ou chip-arrays .
Chaque grille est un carré de 11 micromètres
porteur de séquences d ADN (oligoprobe (
complémentaire à celle de séquences de gènes)
Des Millions de brins de DNA gréffés et
accessibles
6.5 millions de brin sur chaque chip
Brins 25 base pairs
141
(No Transcript)
142
Chaque espèce dARN va hybrider avec la sonde
dADN correspondante sur la puce préalablment
chargée de sondes dADN. La combinaison ARN
biotinylé ADN est fluorescente et donc
repérable par un système de lecture approprié
Fluorescent Stain Biotin
RNA
After staining, RNA (purple) bound to the DNA
probe built on the array will fluoresce
RNA (purple) has bound to its DNA probe built on
the array