Fragment Assembly of DNA

1
Fragment Assembly of DNA

• Esempi, modelli e soluzioni

I.Arduini, G.Caravagna, M.Pavesi
2
Indice

• Storia
• Problema ed esempi
• Modelli
• Algoritmi
• Euristiche
• Assemblatori in pratica

3
Le tappe

• Phage Phi-x174 5kb, 1977
• Bacteriophage lambda 50kb, 1982
• Haemophilius influenzae 1.9Mb, 1995
• Drosophila 180Mb, 2000
• Human 3B, 2001

4
La storia

• Tappe dello shotgun sequencing
• 80s
• Si sequenziavano 5/10 kbp
• lt90
• Si sequenziavano circa 40 kbp
• 1995 (H. influenzae)
• Si supera il limite massimo supposto di 50 kbp
• Primo programma efficiente

5
La storia (I)

• Opinioni di G.Myers
• I risultati del 1995 hanno ispirato me e
  J.Webber a proporre luso dello shotgun
  sequencing per sequenziare il genoma umano
• US National Institutes of Health non li finanzia
• Maggio 1998 nasce Celera

6
La storia (II)

• Celera
• Obiettivi
• 1999 Drosophila
• 2001 Genoma umano

• Costi
• 0.01 per ogni base
• 130M per ogni anno di lavoro (3)
• 90M per software ed hardware

7
La storia (III)

• 26 Giugno 2000
• Celera Genomics annuncia il completamento del
  primo assembly del genoma umano
• HGSC annuncia di aver completato una prima bozza
  dello stesso progetto

8
La storia (IV)

• Febbraio 2001
• I due team pubblicano contemporaneamente le loro
  analisi
• comprovare i loro risultati
• ridurre le critiche
• dimostrare uno scopo comune

9
Celera v.s. HGP
10
Il problema

• Sequenziare lunghi filamenti di DNA
• Problema biologico
• Problema informatico

11
Il problema biologico

• Incapacità tecnica delle macchine
• Frammentazione dei filamenti
• Shotgun
• Sequencing dei frammenti
• Gel elettroforesi

12
Limiti tecnologici

• Metodi Gilbert-Sanger
• 500 1000 basi
• G.H. 3B di basi

ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
13
Frammentazione

• Clonazione
• Virus
• Shotgun
• Enzima

14
Gel Elettroforesi
Tecnica che permette di separare frammenti di
acido nucleico, in funzione del peso molecolare.
15
Il problema informatico

• 500-2000 frammenti di lunghezza tra le 200 e le
  700 basi.
• Riassemblare i frammenti

16
Riassemblare i frammenti

• Esempi
• Caso ideale
• Complicazioni
• Modelli
• Algoritmi
• Approccio pratico

17
Caso ideale - frammenti
A C C G T C G T G C T T A C T A C C G T
18
Caso ideale - overlap
A C C G T C G T G C T T A C T A C C G T
19
Caso ideale allineamento

• - - A C C G T - -
• - - - - C G T G C
• T T A C - - - - -
• T A C C G T - -

T T A C C G T G C
20
Complicazioni (caso reale)

• Errori
• Base call errors (BCE)
• Contaminazione
• Chimere
• Orientamento sconosciuto
• Mancanza di copertura
• Ripetizioni
• Dirette
• Inverse

21
BCE - frammenti

• Errore di lettura (biologico)

A C C G T C G T G C T T A C T G C C G T
22
BCE - overlap

• Errore di lettura (biologico)

A C C G T C G T G C T T A C T G C C G T
23
BCE - layout

• - - A C C G T - -
• - - - - C G T G C
• T T A C - - - - -
• T G C C G T - -
• T T ? C C G T G C

24
BCE - soluzione
A - A G ?

• Selezione per maggioranza
• 2 A
• 1 G
• 1
• Vince la A !!!

25
BCE stringa di consenso

• - - A C C G T - -
• - - - - C G T G C
• T T A C - - - - -
• T G C C G T - -
• T T A C C G T G C

26
Chimere

• Fusione di due sottosequenze non contigue in un
  unico frammento

DNA
frammento
27
Chimere

• Problema biologico
• Durante la clonazione
• Contaminazione dallospite
• DNA Arrays
• Soluzione
• Preprocessing dellinput

28
Chimere - frammenti
A C C G T C G T G C T A C C G T T T A T G C
29
Chimere - overlap
A C C G T C G T G C T A C C G T T T A T G C
T T A T G C
T T A T G C
30
Chimere consenso
- - A C C G T - - - - - - C G T G C T T A - - - -
- -
T T A C C G T G C
T T A - - - T G C
31
Contaminazioni

• Le chimere sono contaminazioni
• Il processo di clonazione sporca i filamenti
  con pezzi di genoma dellorganismo ospite

DNA da clonare e dellospite
Processo di clonazione

• Unica soluzione il
• preprocessing

DNA sporco e quello originale
32
Orientamento Sconosciuto

• I frammenti clonati provengono da una qualsiasi
  delle sequenze
• In principio non sappiamo da quale
• Con n frammenti abbiamo 2n(n-1) coppie
  considerando le 2 eliche

GTCA
complement
ACTG
CAGT
reverse
33
Orientamento - frammenti
C A C G T A C T A C G G T A C T
34
Orientamento quale elica?
C A C G T A C T A C G G T A C T
A C G T G C G T A G T A G T A C
1. genero tutti i possibili frammenti
2. ne scelgo alcuni (come?)
35
Orientamento layout
Ori.
C A C G T - - - - - - - C G T A G T - - - - - - -
A G T A C C A C G T A G T A C
36
Copertura

• La stringa target si riassembla da dei frammenti
• 1. Quanti frammenti vogliamo?
• 2. Quanti sono abbastanza?
• 3. Possono non bastare?

• abbastanza

• non lo sappiamo (non calcolabile)

• sì

?
37
Copertura

• Problema biologico
• Il sampling è un processo casuale

Buon Principio
Più frammenti abbiamo, più è sicuro il consenso
basato sulla maggioranza

• quindi
• Quanti tanti
• Quali non si sa

38
Ripetizioni

• Sequenze che compaiono 2 o più volte nella
  sequenza target

DNA
x
x

• Dato un frammento contenente x, in quale punto
  del target lo assemblo?

• sono sempre pericolose ?

39
Ripetizioni quelle facili

• Quelle facili

x
x
DNA
frammenti

• I segmenti e disambiguano

• Facili quando sono contenute totalmente nei
  frammenti

40
Ripetizioni quelle difficili

• Quelle difficili

x
x
DNA
frammenti
NO
OK
i frammenti collassano !

• Difficili se si spezza una ripetizione

41
Ripetizioni difficili XXX
frammenti
DNA
A x B x C x D
frammenti
consenso
A x C x B x D
42
Ripetizioni difficili XYXY
frammenti
DNA
A x B y C x D y E
frammenti
consenso
A x D y C x B y E
43
Ripetizioni dirette/inverse

• Abbiamo visto quelle dirette
• Facili
• Difficili

Ce ne sono altre?
x
x

• Quelle inverse
• Facili
• Difficili

Ruota 180
x
x
44
Modelli

• SCS (Shortest Common Superstring)
• RECONSTRUCTION
• MULTICONTIG
• Nessuno risolve i problemi biologici
• Chimere
• Contaminazione

45
SCS

• Il problema
• Data una collezione F di stringhe
• Trovare la più breve stringa S tale che per ogni
  f appartanente ad F, S sia una superstringa di f.

46
SCS (II)

• In biologia
• La collezione F è linsieme di frammenti
• orientati
• S è la sequenza del DNA della molecola target

47
SCS (III)

• Limiti
• S deve essere una superstringa perfetta
• Non tiene conto degli errori
• Bisogna conoscere lorientamento
• Quasi sempre impossibile
• La superstringa trovata potrebbe non essere la
  soluzione corretta
• Problema delle ripetizioni

48
SCS (IV)

• In conclusione
• Il problema SCS è NP-hard
• Esistono algoritmi di approssimazione
• Non sono interessanti
• Limiti del modello

49
RECONSTRUCTION

• Il problema
• Dati
• una collezione F di stringhe
• Un margine di errore e, 0ltelt1
• Trovare la più breve stringa S tale che per ogni
  f appartanente ad F, sia
• Min(ds(f,S),ds(-f,S))lt ef

50
RECONSTRUCTION (II)

• Min(ds(f,S),ds(-f,S))lt ef
• ds è la substring edit distance
• Edit distance ignorando cancellazioni alle
  estremità della seconda sequenza.
• ds(a,b) min d(a,s)
• Dove s è una qualsiasi sottostringa di b
• e è il livello di errore tollerato
• f è la lunghezza della stringa f
• Cosa significa tutto questo?

51
RECONSTRUCTION (III)

• Cosa significa tutto questo?
• Errore tollerato e per ogni base.
• e0.05 significa che sono ammessi 5 errori ogni
  100 basi.
• Cerco una stringa S
• di dimensioni minime
• ogni frammento (o inverso) è sottostringa di S
  con margine e.

52
RECONSTRUCTION (IV)

• Vantaggi
• Tiene conto degli errori
• Svantaggi
• Non risolve il problema delle chimere
• Il problema è ancora NP-hard
• Contiene SCS come caso particolare con e 0

53
MULTICONTIG

• Introduce il concetto di good linkage

Def good linkage
Misura del livello di sovrapposizione di frammenti
--TAATG TGTAA--
Livello di collegamento 3
54
MULTICONTIG (PRO)

• PRO
• Errori (Base Call Errors)
• Orientamento
• Mancanza di copertura
• Ripetizioni?

55
MULTICONTIG (CONTRO)

• CONTRO
• Non sfrutta le informazioni relative alla
  dimensione della molecola target
• NP-hard
• Cammini Hamiltoniani
• Ripetizioni?

56
MULTICONTIG (Def. I)

• F collezione di frammenti
• L allineamento multiplo dei frammenti (Layout)

• T G T A A - - - - -
• - T A A T G - - -
• - - - - - - G T A C

57
MULTICONTIG (Def. II)

• Numerazione delle colonne
• Per ogni frammento f si l(f) e r(f)
• Il valore di l e r dipende dalla colonna

r(f1)1
l(f1)1

• 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
• T G T A A - - - - -
• - T A A T G - - -
• - - - - - - G T A C

f1
58
MULTICONTIG (Def. III)

• fr(f) - l(f) 1
• Overlap x..y
• intersezione l(f)..r(f) e l(g)..r(g)
• Nonlink se un altro frammento contiene
  propriamente x..y
• Link altrimenti
• Weakest link la più piccola dimensione dei link
  della collezione

59
MULTICONTIG (VII)

• T-contig
• Un layout L è un t-contig se il suo weakest link
  ha dimensione t
• Una collezione F ammette t-contig se è possibile
  costruire un t-contig con i suoi frammenti

60
MULTICONTIG (formulazione error-free)

• PROBLEMA Multicontig
• INPUT
• F, collezione di stringhe
• t0, intero
• OUTPUT
• Una partizione di F nel minimo numero di
  sottocollezioni Ci , 1ik, tale che ogni Ci
  ammetta un t-contig

61
MULTICONTIG (esempio)

• FGTAC,TAATG,TGTAA
• t3
• t2
• t1

T G T A A - - G T A C - - T A A T G
- - - T G T A A G T A C T A A T G - - -

• T G T A A - - - - -
• - T A A T G - - -
• - - - - - - G T A C

62
MULTICONTIG (errori)

• Si associa a L una sequenza di consenso S
• Immagine di f nel consenso Sl(f)..r(f)
• Tolleranza di errore e
• e-consenso S è un e consenso per questo contig
  quando la distanza di edit fra ciascuno frammento
  allineato f e la sua immagine nel consenso è al
  più ef.

63
MULTICONTIG (formulazione)

• PROBLEMA Multicontig
• INPUT
• F, collezione di stringhe
• t0, intero
• 0e1, tolleranza di errore
• OUTPUT
• Una partizione di F nel minimo numero di
  sottocollezioni Ci , 1ik, tale che ogni Ci
  ammetta un t-contig con un e-consenso

64
MULTICONTIG (complessità)

• Np-arduo
• Anche nel caso error-free e orientamento noto
• Contiene una istanza di cammino hamiltoniano

65
Indice Algoritmi

• Rappresentare gli Overlap
• Overlap Multigraph
• Superstringhe e cammini
• SCS come cammini su grafi
• Algoritmo Greedy
• Sottografi aciclici

66
Rappresentare gli Overlap(I)

• Dati due frammenti
• f1 TACGAA
• f2 AACA
• Quanti modi ci sono di sovrapporli?

t
TACG AA AA CA

• t2

f1
f2
t
Ordinamento f su un grafo
TACGA A A ACA

• t1

f2 f f1
TACGAA AACA
t

• t0

67
Rappresentare gli Overlap(II)

• FTACGA, ACCC, CTAAAG, GACA
• Grafo
• Escludendo da subito le sovrapposizioni nulle
  (concatenazioni di frammenti)

ACCC
TACGA
CTAAAG
GACA
68
Rappresentare gli Overlap(III)
ACCC
TACGA
CTAAAG
GACA
TACGA ACCC
ACCC CTAAAG
GACA ACCC
69
Overlap Multigraph (I)

• OM(F)(F,A)
• I nodi rappresentano i frammenti
• (a,b), con peso t0 Î A ? suffix(a, t)
  prefix(b, t)

t
t
prefix(b,t)
b
a
b
suffix(a,t)
a
t 2
2
TAGC AA
a
TAGCAA
AAGC
AA GC
b
70
Overlap Multigraph (II)

• Raffinamenti possibili
• Elevato numero di nodi n
• Elevato numero di archi
• n2 solo per t0
• Valore di soglia su t
• Eliminare gli overlap troppo deboli
• Poco significativi
• Errori?

71
Superstringhe e cammini

• I cammini in un OM rappresentano un allineamento
  multiplo.
• La sequenza di consenso è una superstringa comune
  ai frammenti del cammino
• Non necessariamente la più corta.

72
Superstringhe e cammini(II)

• Cammini come sequenze di archi
• Più di un arco tra due nodi

t
TACG AA AA CA
2
t
TACGA A A ACA
1
TAGCAA
AAGC
0
TACGAA AACA
t
n overlap tra due frammenti generano n cammini
fra due nodi
73
Superstringhe e cammini(III)

• Overlap multigraph
• Quanti cammini?

ACCC
1
TACGA
2
1
1
CTAAAG
1
GACA
74
Superstringhe e cammini(III)
ACCC
1
TACGA
2
1
1
CTAAAG
1
GACA
TACGA----------- ----ACCC-------- -------CTAAAG---
------------GACA TACGACCCTAAAGACA
75
Superstringhe e cammini(III)
ACCC
1
TACGA
2
1
1
CTAAAG
1
GACA
TACGA---------- ---GACA-------- ------ACCC----- --
-------CTAAAG TACGACACCCTAAAG
consenso più corto
76
Considerazioni (I)

• Come scegliere un cammino?
• Due modi

Massimizzo S pesi
Senza regole
CS-Problem Common Superstring
SCS-Problem Shortest Common Superstring
77
Considerazioni (II)

• Ma in fondo, quali cammini vogliamo?

• Hamiltonian Path (HAM)

HAM
Un cammino in un grafo non orientato che visita
tutti i vertici una e una sola volta
HAM Î NP-C
78
Overlap Graph (OG)

• Vogliamo cammini di peso massimo
• Eliminiamo
• Tra archi paralleli quelli meno pesanti

2
1
2
TAGCAA
AAGC
TAGCAA
AAGC
0
79
LAlgoritmo

• Un tentativo greedy per calcolare
• Cammino di peso massimo sull OG

IDEA
Scegliere, al passo i-esimo, larco di peso
massimo tra quelli non ancora attraversati. Questo
arco non deve interferire con il cammino HAM che
stavamo costruendo al passo (i-1)-esimo
Ordinamento decrescente degli archi rispetto ai
pesi
80
LAlgoritmo terminazione

• OG è completo
• Tra due nodi esiste sempre un arco

Se F n , allora ci fermiamo quando il cammino
è lungo (n-1) nodi. Il cammino calcolato toccherà
tutti i nodi del grafo.
81
LAlgoritmo variazioni

• Vediamo lalgoritmo direttamente su F
• Scegli ( f, g ) Î F di peso massimo
• Sovrapponi f a g secondo loverlap
• Togli f e g da F
• Aggiungi la sovrapposizione a F

Ci fermiamo quando F 1

• Otteniamo sempre il miglior risultato?

82
Un esempio

• F GCC,ATGC,TGCAT

GCC
Passo Peso F
1 3 GCC,ATGCAT
2
2 0 ATGCATGCC
2
ATGC
TGCAT
GCC
3
0
ATGCAT
ATGCATGCC
83
Un esempio(II)

• Un cammino alternativo migliore

GCC
2
2
0
2
2
ATGC
TGCAT
3
3
ATGCATGCC v.s. TCGCATGCC
84
SOTTOGRAFI ACICLICI

• Basato sul modello Multicontig
• Buon Campionamento
• I frammenti coprono lintera molecola
• Le connessioni fra frammenti sono sufficienti

85
Campionamento

• SA,C,G,T
• Campionamento di S
• Collezione A di intervalli di S
• A copre S
• Se per ogni 1 i S abbiamo almeno un
  intervallo j..k? A t.c. i ? j..k

86
Connessione

• Due intervalli a e b sono connessi a livello t
• se anbt
• Un campionamento di A è connessa a livello t
• Se per ogni coppia a e b ? A esiste una serie di
  intervalli ai con 0il t.c. aa0, bal e ai è
  connessa a livello t con ai1 per 0il-1

87
Copertura esempio

• Campionamento di A connesso a livello t

• È sufficiente che ogni coppia di intervalli abbia
  una catena di intervalli luno con laltro
  sovrapposto a livello t

G C C C C A T G T G A G A G
T G

• GCC e AGTG non sono connessi a livello 2, ma il
  campionamento è comunque connesso a livello 2

88
Buon campionamento

• Un campionamento è buono se A è connesso ad un
  livello t prefissato
• t è 10, tipicamente.
• Studieremo quindi collezioni di frammenti
  connessi a livello t che coprono una stringa S

89
Modifica al grafo

• Si tagliano da OM(F) tutti gli archi da f a g che
  pesino meno di t
• Gli archi connettono solo nodi corrispondenti a
  intervalli connessi a livello t
• Si indica con OM(F,t)

90
Concettualmente

• Nel grafo
• gli archi sono le sovrapposizioni
• I nodi sono intervalli
• Stringa cercata cammino che non visiti due
  volte un nodo e visiti tutti i nodi
• Cammino Hamiltoniano
• Esiste?

91
Cammini Hamiltoniani

• Si può dimostrare che, dati
• Una stringa S sullalfabeto A,C,G,T
• Una collezione A connessa a livello t,
  campionamento di S.
• Allora il multigrafo OM(F,t)
• Con F generato da A
• Ammette un cammino Hamiltoniano P.
• Se A copre S, allora P può essere scelto tale che
  S(P)S.

92
Intuitivamente

• Condizioni sufficienti per la presenza di un
  cammino hamiltoniano
• Il cammino hamiltoniano rappresenta una stringa
• ci si muove su frammenti sovrapposti, ovvero
  susseguenti
• In assenza di cicli, questo cammino si dimostra
  essere unico

93
Problema

• Abbiamo F, vogliamo ricostruire S
• Trovando un cammino hamiltoniano
• Possiamo farlo?

94
Presenza di ripetizioni

• Cicli nel grafo gt ripetizioni nel grafo
• Il contrario non sempre è vero
• Intersezione comune fra due intervalli è dovuta a
  uno fra
• Sovrapposizione (overlap)
• Ripetizione
• Si dimostra che in caso di ciclo nel grafo,
  esisten almeno una ripetizione

95
Unicità del cammino hamiltoniano

• Trasformare il multigrafo OM in un grafo aciclico
  OG
• Se S non ha riptezioni, il cammino hamiltoniano
  su OG esiste ed è unico
• Il cammino hamiltoniano rappresenta la stringa
  target ricercata

96
Topological sorting

• Questo approccio è noto come Topological Sorting
• Trovare un ordinamento di nodi consistente con un
  insieme aciclico di archi
• In cui gli archi rappresentino un ordinamento

97
Greedy VS Acyclic Subgraph

• SAGTATTGGCAATCGATGCAAACCTTTTGGCAATCACT
• wAGTATTGGCAATC
• zAATCGATG
• uATGCAAACCT
• xCCTTTTGG
• yTTGGCAATCACT

98
Greedy VS Acyclic Subgraph
Greedy w, y, z, u, x
9
3
3
4
3
Sottografi aciclici w, z, u, x, y
x
w
u
y
z
99
Greedy VS Acyclic Subgraph

• Greedy
• Lunghezza 36
• Weakest Link 0
• Superstringa
• Sottografi aciclici
• Lunghezza 37
• Weakest Link 3
• Superstinga

100
Vince Acyclic Subgraph

• Fra i due, prevale la logica del migliore livello
  di sovrapposizione
• Anche se la superstringa minore è quella
  generalmente preferibile

101
Euristiche

• Nessun formalismo è adeguato
• Ci buttiamo sulle euristiche
• Quanto è adeguato un allineamento?
• Scoring
• Coverage
• Linkage
• Assembly in pratica

102
Scoring

• Situazione ideale
• In ogni colonna, un solo carattere
• Uniformità bene
• Variabilità male

103
Scoring entropia

• Entropia
• Definita su frequenze relative
• Bassa ? una frequenza spicca nel gruppo
• Alta ? frequenze omogenee
• Su una colonna
• 4 A, 1 G
• Entropia bassa, si sceglie A
• 3 A, 2G
• Entropia alta, non si sa cosa scegliere

104
Scoring in pratica

• Allineamento buono
• Entropia bassa
• Sappiamo cosa scegliere per ogni colonna

105
Coverage

• Un frammento copre una colonna?
• Siano l(f) e r(f) gli estremi sinistro e destro
  di f
• f copre la colonna i se l(f)ir(f)

aCAGTC--- b--GTCAT- c----CAT-
a e b coprono la colonna, c no
106
Coverage (II)

• Coverage di una colonna
• Numero di frammenti che la coprono
• Coverage0 per una colonna
• Layout disconnesso

Coverage0 !
CATAG------------- ---AGTCGA--------- ----------CT
AGACTA
107
Coverage (III)

• In conclusione
• Più colonne con coverage0
• Qualsiasi permutazione delle regioni tra di esse
  è accettabile.
• Regionecontig
• Coverage alta consensus affidabile

108
Linkage

• Il modo in cui ogni frammento si lega agli altri
• Presenza di overlaps

------ACTTTT------ TCCGAG------ACGGAC ------ACTTTT
------ TCCGAG------ACGGAC
Esempio di buona copertura ma scarso linkage
109
Assembly in pratica

• Un buon algoritmo deve
• bilanciare
• Scoring
• Coverage
• Linkage
• trovare tutte le soluzioni buone
• Un compito difficile, quindi?

110
Assembly in pratica (II)

• Un compito difficile
• Si divide il problema in tre fasi
• Trovare overlaps
• Costruire un layout
• Calcolare un consensus
• Modello overlap-layout-consensus

111
Assembly in pratica (III)

• Si divide il problema in tre fasi
• Pro
• Più gestibile
• Contro
• Difficile capire la relazione tra input e output

112
Assembly in pratica (IV)

• Di fatto
• I metodi usati nelle tre fasi sono spesso
  euristici
• Nessuna garanzia sulla qualità della soluzione
• Ci sono molte implementazioni
• Buone allatto pratico
• Vale la pena studiare le tecniche

113
Trovare overlaps

• Proviamo ogni coppia di frammenti
• Anche i complementari inversi
• Con un margine di errore
• Algoritmo di programmazione dinamica
• Nessuna penalità per gaps alle estremità
• 1 match
• -1 mismatch
• -2 gaps

114
Costruire un layout

• Trovare un buon ordinamento dei frammenti in un
  contig.
• Ogni frammento si sovrappone al successivo
• Si trova il layout

115
Costruire un layout (II)

• Non esiste un algoritmo
• Semplice
• Generale
• Neanche affidandosi alle euristiche
• Facciamo considerazioni pratiche
• Da tenere a mente

116
Costruire un layout (III)

• Considerazioni pratiche
• Complementari inversi
• Espandere F con gli inversi
• Se due frammenti hanno overlap, anche i loro
  inversi lo hanno
• Errori
• Matching approssimato

117
Costruire un layout (IV)

• Considerazioni pratiche
• Trovare percorsi diretti sull OG
• Significa trovare ordinamenti
• Si costruisce contemporaneamente linverso
• Vengono costruiti entrambi i filamenti del DNA
• Due ostacoli
• Mancanza di coverage
• Ripetizioni

118
Costruire un layout (V)

• Mancanza di copertura
• Deriva da un grafo disconnesso
• Ripetizioni
• Causano cicli nel grafo
• Se la copertura è buona
• Creano ambiguità
• Danno coverage stranamente alto
• Tutte le copie sono impilate insieme
• La coverage sale

119
Costruire un layout (VI)

• Per concludere
• Percorsi complementari
• Ignorare frammenti contenuti
• Cicli indicano ripetizioni
• Coverage strano
• Può derivare da ripetizioni

120
Consensus

• Abbiamo un ordinamento di frammenti
• Come li disponiamo?
• Banale nel caso ideale
• Problematico con overlaps approssimati

121
Consensus (II)

• Abbiamo un ordinamento
• f?g?h
• f CATAGTC
• g TAACTAT
• h AGACTATCC
• Due allineamenti possibili tra f e g

CATAGTC--- --TAA-CTAT
CATAGTC--- --TA-ACTAT
Problema stesso punteggio!
122
Consensus (III)

• Due allineamenti possibili tra f e g
• Con lo stesso punteggio
• Quando entra in gioco h

CATAGTC----- --TAA-CTAT-- ---AGACTATCC CATAG?CTATC
C
CATAGTC----- --TA-ACTAT-- ---AGACTATCC CATAGACTATC
C
123
Consensus (IV)

• Evidenziamo le differenze tra frammenti e
  consensus

CATAGTC----- --TAA-CTAT-- ---AGACTATCC CATAG?CTATC
C
CATAGTC----- --TA-ACTAT-- ---AGACTATCC CATAGACTATC
C
2 differenze 1 differenza
124
Consensus (V)

• In pratica
• Struttura dati che distingue
• Basi già piazzate da altri frammenti
• Basi con posizionamento ambiguo
• Sequenza come lista di nodi (basi)

125
Consensus (VI)

• Sequenza come lista di nodi (basi)

126
Assemblatori

• Due generazioni
• Prima (19921998)
• CAP
• Phred Phrap
• Seconda(1995..)
• TIGR
• Celera

127
Assemblatori prima generazione

• Contig Assembly Program (CAP) di Xiaoqiu Huang,
  Genomics
• Risolve SCS con programmazione dinamica su coppie
  di frammenti
• Del 1992, migliorato in CAP2 nel 1996

As to performance, CAP took 4 hours to assemble
1015 fragments of a total of 252,000 characters
on a Sun SPARCstation SLC
http//www.cs.sunysb.edu/algorith/implement/cap/i
mplement.shtml
128
Assemblatori prima generazione

• Phred Phrap di Phil Green, Laboratory of Phil
  Green
• Del 1998

• Approccio
• Controllo della qualità dei frammenti
• Guidato da una euristica

129
Assemblatori seconda generazione

• The Institute for Genomic Research (TIGR)
• Nel 1995 sequenzia H.influenzae (1.8Mb)

• Approccio
• Utilizzo di strutture dati sofisticate
• Unitigs (UNIquely Assemblable conTIG)
• Scaffold (unitigs contigui ed ordinati)

130
Assemblatori seconda generazione

• Celera Genomics

131
Celera pipeline

• Screener
• Cerca le ripetizioni conosciute in un database
• Il database per la Drosophila era fatto a mano

• Overlapper
• Ogni frammento viene comparato con quelli
  precedentemente esaminati
• Differenza lt 6
• Overlap più lunghi di 40 basi
• Lapproccio è quello di BLAST

132
Celera pipeline

• Unitigger
• Riunisce frammenti non ambigui in unitigs
• U-unitigs quelli fuori dalle ripetizioni

• Scaffolder
• U-unitigs vengono raccolti in insiemi di contig
  di dimensione nota orientati ed ordinati

133
Celera pipeline

• Repeat Resolution
• Elimina le ripetizioni note
• Aggiorna il database

• Consensus

La qualità della sequenza è così alta che il
consenso è ottenuto da un semplice algoritmo
denominato Abacus
Myers et al
134
Osservazioni finali

• Overlap Layout Consensu le tecniche più
  avanzate per la fase Layout sono NP-hard
• Ma il vero ostacolo è nella fase Overlap, anche
  se quadratica
• 3Miliardi di basi x 12 (copertura) x 2
  (orientamento)

135
Osservazioni 2

• Celera e HGSC hanno annunciato di aver
  sequenziato del genoma umano
• Come si fa a dare questa valutazione, se non si
  può confrontare il risultato con il vero
  genoma?
• Metro di valutazione lunghezza
• Siamo davvero simili al topo per il 99 del
  genoma?

136
Osservazioni 3

• La soluzione del problema biologico è stata
  favorita dall'Informatica
• Ma l'informatica ha fino ad ora fatto uso dei
  PROPRI mezzi principalmente
• E' possibile sfruttare meglio i vincoli
  biologici?
• Uso di database come guida