Poznanie genomu czlowieka (wg. artykul

1
Poznanie genomu czlowieka(wg. artykulów z
Science i Nature)

• Jerzy Tiuryn
• Instytut Informatyki
• Uniwersytet Warszawski

2
(No Transcript)
3
Dwa artykuly

• Initial sequencing and analysis of the human
  genome, International Human Genome Sequencing
  Consortium, Nature, 15.02, 2001 (860-921).
• The sequence of the human genome, J.C. Venter,
  et.al., Science, 16.02. 2001 (1304-1351).

4
Plan wykladu

• Historia poznania genomu czlowieka.
• Metoda konsorcjum (hierarchiczne sekwencjonowanie
  metoda shotgun).
• Metoda Ventera whole-genome shotgun approach.
• Co wiadomo o liczbie genów w genomie czlowieka?
• Porównanie obu metod.

5
Historia poznania genomu czlowieka

• 1953, James Watson, Francis Crick, struktura
  DNA.

6

• 1977, F. Sanger (metoda dideoxy), 500-750bp.
• 1977, F. Sanger zsekewncjonowanie pierwszego
  ludzkiego genu.
• 1977-82, genomy bakteryjnych wirusów (fX174,
  Lambda), genom wirusa zwierzecego SV40, ludzkie
  mitochondrium.
• 1985, K. Mullis technika PCR.
• 1987, D. Burke, M. Olson, G. Carle YAC.
• 1989, Olson, Hood, Botstein, Cantor strategia
  mapowania przy uzyciu STS.

7

• 1995, J.C. Venter (Heamophilus influenzae) 1.8
  Mb, metoda whole-genome shotgun sequencing.
• 1996, Miedzynarodowe konsorcjum (Saccharomyces
  cerevisiae) 13.5 Mb.
• 1997, Blattner, Plunkett (Escherichia coli) 5 Mb.
• 1998, Venter zalozenie firmy Celera Genomics
  (deklaracja sekwencja genomu czlowieka w 3 lata,
  za 300 M).

8

• 1998, Sulston, Waterson (Caenorhabditis elegans)
  100 Mb.
• 1999, GB, Japonia, USA chromosom nr.22, 35 Mb.
• 2000, Venter (Drosophila melanogaster) 120 Mb,
  testowanie metody WGSS dla niezbyt duzego genomu.
• 2000, Niemcy, Japonia chromosom nr. 21, 34 Mb.
• 2000, Miedzynarodowe Konsorcjum (Arabidopsis
  thaliana), 100 Mb.
• 2001, HGP i Celera publikuja draft genomu
  czlowieka, 3.3Gb.

9
Glówne trudnosci w sekwencjonowaniu genomu
czlowieka

• Rozmiar genomu (3Gb).
• Duza czesc genomu zawiera repetytywne fragmenty.
  Przykladowo czesc genomu zawierajaca repetytywne
  fragmenty dla róznych organizmów
• Bakterie 1.5
• Muszka owocowa 3
• Czlowiek gt50

10
Metoda Konsorcjummap-based, BAC-based,
clone-by-clone

• Pozyskiwanie materialu genetycznego.
• Budowa mapy fizycznej genomu w oparciu o klony.
• Trawienie poszczególnych klonów enzymami
  restrykcyjnymi odcisk palca.
• Budowa kontigów i przypisanie ich do miejsc na
  chromosomach (STS).
• Wybór klonów z kontigów do sekwencjonowania.
• Sekwencjonowanie metoda shotgun wybranych
  klonów.
• Skladanie genomu.

11
(No Transcript)
12
Pozyskiwanie materialu genetycznego

• Ochotnicy (rózne srodowiska etniczne), kto
  pierwszy ten lepszy.
• Samplig laboratory usuniecie identyfikatorów,
  nadanie losowych oznaczen, przeslanie do
  processing lab.
• Processing laboratory usuwa wszystkie oznaczenia
  i zmienia je na inne, niszczy dokumentacje
  oznaczen, wybiera losowo 5-10 próbek do dalszej
  analizy.

13
Linia produkcyjna do przygotowywania
próbek Whitehead Institute, Center for Genome
Research
14
Klony

• Plazmidy ( 4Kb).
• Kosmidy ( 40Kb).
• Yeast Artificial Chromosome, YAC (do 500Kb).
• Bacterial Artificial Chromosome, BAC (100-300Kb).

15
Mapa fizyczna

• Biblioteki klonów zbudowane z materialu
  genetycznego. (1.400.000 klonów BAC lub PAC,
  65-krotne pokrycie genomu). Kazdy klon rozmiaru
  100-200Kb.
• Wybrano 350.000 klonów do budowy mapy
  fizycznej. (20 krotne pokrycie genomu).
• Kazdy klon poddano trawieniu enzymem
  restrykcyjnym i zmierzono rozmiary fragmentów
  przy pomocy elektroforezy na zelu z agarozy. Tak
  powstaje linia papilarna (fingerprint) klonu.
• Linie papilarne sa uzyte do identyfikacji klonów
  i do szacowania wielkosci nalozenia jednego klonu
  na drugi.

16
Mapa fizyczna, c.d.

• Linie papilarne klonów zostaly uzyte do budowy
  tzw. kontigów (nakladajace sie na siebie spójne
  fragmenty utworzone z klonów).
• Kontigi zostaly przyporzadkowane miejscom na
  chromosomach przy pomocy znaczników STS (STS
  Sequence Tagged Site 500bp, jednoznaczna
  sekwencja na chromosomie, dla której sa znane
  primery PCR).

17
Przyklad dwóch kontigów
18
Faza sekwencjonowania

• Wybór klonów z kontigów, tak aby uzyskac pokrycie
  genomu (aby przyspieszyc proces, zrezygnowano z
  poszukiwania minimalnego pokrycia). Wybrano
  30.000 klonów.

19
Faza sekwencjonowania kazdy klon metoda shotgun

• Klon powiela sie w wielu kopiach.
• Wszystkie kopie tnie sie na male kawalki (enzymy
  restrykcyjne) losowo. Porzadek i orientacja
  kawalków sa tracone.
• Wybiera sie losowo dostatecznie duzo kawalków
  (5-10 krotne pokrycie, zgodnie z formula
  Landera/Watermana) i dla kazdego kawalka
  sekwencjonuje sie prefiks o dlugosci 500bp.
  Powstaja tzw. czyste odczyty.

20
Uwagi na temat metody shotgun

• W praktyce wybór fragmentów nie jest jednorodny
  (powody molekularno-biologiczne, a nie
  probabilistyczne). To powoduje powstawanie dziur
  w odczytywanej sekwencji.
• Sa dwa stopnie jakosci metody shotgun
• half-shotgun 4-5 krotne pokrycie, w wyniku mamy
  draft genomu.
• full-shotgun 8-10 krotne pokrycie, w wyniku
  mamy podstawe do dokladnego opisu genomu.

21

• Uzyskano 23Gb danych w czystych odczytach.
• Niektóre centra osiagnely wydajnosc 100.000
  reakcji sekwencjonowania na 12 godzin.
• Wydajnosc wszystkich centrów osiagnieta w czerwcu
  2000 1 pokrycie genomu na 6 tygodni (1Kb/sek.
  przez 24h/dobe, caly czas).
• Kazdy nukleotyd byl odczytany srednio 4.5 raza.

22

• 7.10.00 w postaci finalnej bylo 835Mb sekwencji
  genomu (wliczajac chromosomy 21 i 22). Na koniec
  roku 2000 bylo 1Gb sekwencji w finalnej postaci
  (finalna postac prawdopodobienstwo bledu
  odczytu nukleotydu lt 1/10.000, zadnych dziur)

23
Skladanie sekwencji (1)

• Analiza nalozen (overlap detection) dane dwa
  slowa W,V, znajdz sufiks w W oraz prefiks w V o
  maksymalnym podobienstwie (w sensie uliniowienia
  moga byc wstawiane spacje). Jest to problem
  natury algorytmicznej. Dane o nalozeniach
  przechowujemy.

24
Skladanie sekwencji (2)

• Ulozenie podslów (substring layout). Zachlanny
  algorytm znajdz pare slów o maksymalnym
  podobienstwie sufiks/prefiks. Pózniej nastepna
  pare. Albo powstaja dwa kontigi, albo jeden o
  trzech slowach. Podobne do wielokrotnego
  uliniowienia. Dodawanie nowych par powoduje
  wstawianie spacji (rozsuwanie). W ten sposób
  powstaja kontigi nakrywajace wiekszosc
  odtwarzanej sekwencji.

25
Skladanie sekwencji (3)

• Decydowanie konsensusu uzgodnienie jaka litera
  ma stac na danej pozycji w kontigu. Stosowane sa
  rózne podejscia, czesto metoda wiekszosciowa (tu
  sa subtelne problemy).
• W projekcie srednie pokrycie klonu kontigami
  wynosilo 96, a srednie przerwy pomiedzy
  kontigami mialy 500bp.

26
Dwa rodzaje kontigów

• Kontigi pochodzace z jednego klonu.
• Mega-kontigi pochodzace z analizy linii
  papilarnych poszczególnych klonów.

27
Logistyka skladania genomu

• Skladanie pojedynczych klonów.
• Zwiazanie zsekwencjonowanych klonów z pozycjami
  na fizycznej mapie genomu.
• Poprawianie niezgodnosci.

28
(No Transcript)
29
Kroki w procesie skladania genomu z kontigów
pochodzacych z klonów A i B.
30
Jakosc draftu genomu zsekwencjonowanego przez
konsorcjum

• Uzyto oprogramowanie PHRAP (program przypisuje
  kazdemu nukleotydowi prawdopodobienstwo bledu).
• 91 sekwencji ma blad lt 1/10.000.
• 96 sekwencji ma blad lt 1/1.000
• Sa przerwy w sekwencji.

31
Przerwy w sekwencji (3 rodzaje)

• Pomiedzy kontigami w poszczególnych klonach
  lacznie 2-4 genomu jest zawarte w takich
  przerwach (80Mb). Tych przerw jest 145.000.
• Pomiedzy klonami w mega-kontigach 5 genomu
  (150Mb). Jest ich 4.000.
• Pomiedzy mega-kontigami (szacowanie na podstawie
  chr. 21 i 22) 4 genomu.

32
Co wiadomo na temat liczby genów?

• W malych genomach geny sa scisle zwiazane z
  ORFami (ORF Open Reading Frame).
• U czlowieka srednia dlugosc eksonu 145bp,
  natomiast introny sa dlugie (srednio 3300bp, ale
  zdarzaja sie introny dlugosci gt 10Kb).
  Przykladowo introny (srednio)
• u robaka (267bp),
• u muchy (487bp).

33
Geny RNA (nie-kodujace)

• Takie jak tRNA, rRNA, itd.
• Nie maja ORFów.
• Sa male i nie zawieraja ogonów poly(A).
• Trudne do odróznienia od pseudogenów.
• Lacznie znaleziono w drafcie 700 genów RNA.

34
Przyklad

• Klasyczne (podrecznikowe) oszacowanie liczby
  genów tRNA u czlowieka to 1310, ale ... okazalo
  sie, ze jest ich w drafcie genomu tylko 497.

35
Dla innych organizmów liczba genów tRNA wynosi
36
Geny kodujace bialka

• Znanych jest obecnie nieco ponad 10.000 sekwencji
  mRNA w bazie RefSeq (czesc bazy GenBank).
  Zrobiono uliniowienie z draftem genomu. Nieco
  ponad 9.000 dalo sie (przynajmniej czesciowo)
  uliniowic. 16 sekwencji mRNA wykazalo
  podobienstwo do wiecej niz jednego wystapienia w
  drafcie genomu (paralogi, pseudogeny).

37
Geny kodujace bialka (rozmiary)

• Duzy rozrzut w rozmiarach genów (eksony i
  introny) czlowieka. Wiele jest dluzszych niz
  100Kb (rekordzista gen dystrofiny (DMD) ma
  2.4Mb.
• Dlugosc kodujacej sekwencji tez podlega duzym
  wahaniom. Np. gen titiny (najdluzsza obecnie
  znana dlugosc kodujacej sekwencji) ma 80.780bp,
  liczba eksonów 178, najdluzszy ekson 17.106bp.

38
Trudnosci w znajdowaniu genów w genomie czlowieka

• Maly iloraz sygnal/szum w genach czlowieka w
  zwiazku z krótkimi eksonami i bardzo dlugimi
  intronami. Ponadto kodujace sekwencje stanowia
  bardzo mala czesc genomu. Tak nie jest w
  drozdzach, robaku i muszce.
• Znajac nawet dokladnie genom (tak jak to jest dla
  chr. 21 i 22) nadal bedzie bardzo trudno odkrywac
  geny ab initio .

39
Przewidywanie liczby genów (1)

• W latach 80-tych Gilbert zasugerowal, ze moze byc
  100.000 genów w genomie czlowieka. Jest to tzw.
  rachunek back-of-the-envelopeTypowy gen ma
  rozmiar 30.000bp, rozmiar genomu jest 3Gb, wiec
  otrzymujemy 100.000 genów.
• Analiza na podstawie szacunku liczby wysp CpG
  oraz czestosci zwiazków z genami dala
  70.000-80.000 genów.

40
Przewidywanie liczby genów (2)

• Szacunki oparte o EST (EST Expressed Sequence
  Tags) dawaly rozrzut liczby genów w granicach
  35.000-120.000.

41
Obecnie stosowane metody znajdowania genów

• Wystapienie znanego EST lub mRNA.
• Sekwencyjne podobienstwo do znanych genów lub
  bialek.
• Ab initio metoda oparta na ukrytych modelach
  Markowa (HMM) uzywaja one statystycznej
  informacji na temat miejsc splicingu, kodowego
  odchylenia (coding bias), dlugosci eksonów i
  intronów (Genscan, Genie, FGENES).

42
Skutecznosc metod ab initio

• Szacuje sie, ze dla muchy pojedyncze eksony moga
  byc odgadywane poprawnie z prawdopodobienstwem
  90, ale wszystkie eksony danego genu tylko z
  prawdopodobienstwem 40.
• Dla czlowieka podobne liczby wynosza 70 i 20.
• Niektórzy uwazaja tez, ze w/w liczby sa zbyt
  optymistyczne...

43
Initial Gene Index (IGI)

• System Ensembl (uzywa Genscan, weryfikuje w
  oparciu o podobienstwo do bialek, mRNA, EST i
  bialkowych motywów (zawarte w bazie Pfam) dla
  wszystkich organizmów). System ten wygenerowal
  35.000 predykcji genów oraz 44.860 transkryptów.
• Po wykonaniu pewnej redukcji fragmentacji
  otrzymano 31.778 predykcji genów. To stanowi
  podstawe do pierwszej wersji IGI.

44
Initial Gene Index (IGI)

• W IGI jest 15.000 znanych genów i 17.000
  predykcji nowych genów.
• Przyjmuje sie, ze bardziej realna liczba genów w
  IGI to 24.500 genów (20 blednych predykcji lub
  pseudogenów, 1.4 wspólczynnik fragmentacji).
• Przyjmujac, ze predykcje genów zawieraja 60
  wczesniej nieznanych genów, mozna oszacowac
  laczna liczbe genów czlowieka na 31.000.

45
Koncowe uwagi na temat liczby genów czlowieka

• Obecne szacunki liczby genów oparte na
  próbkowaniu daja przedzial 30.000-35.000.
• Jesli w genomie czlowieka jest 30.000-35.000
  genów i srednia dlugosc kodujacej sekwencji
  wynosi 1.400bp oraz srednia dlugosc calego genu
  wynosi 30Kb, to 1.5 calego genomu zajmuja
  sekwencje kodujace, a 30 zajmuja geny.

46
Koncowe uwagi na temat liczby genów czlowieka

• Wydaje sie, ze czlowiek ma dwa razy wiecej genów
  niz robak lub mucha. Geny czlowieka sa bardziej
  rozciagniete po genomie i sa one uzywane do
  budowy wiekszej liczby alternatywnych
  transkryptów. Lacznie, byc moze, czlowiek
  wytwarza 5 razy wiecej bialkowych produktów niz
  robak czy mucha.

47
Jaka jest naprawde liczba genówu czlowieka ...?
Michael Zhang ze wspólpracownikami (Cold Spring
Harbour Laboratory) opracowali program First
Exon Finder (grudzien 2001, Nature Genetics).
Program ten wyszukuje odcinki zawierajace
nie-kodujace pierwsze eksony oraz sekwencje
promotorowe genów. Program poprawnie
zlokalizowal 90 genów w zsekwencjonowanych
chromosomach 21 i 22. First Exon Finder
wytypowal 68,000 genów w genomie czlowieka.
Autorzy szacuja, ze calkowita liczba genów w
genomie czlowieka waha sie w granicach
50,000-60,000. Co bedzie dalej ... ?
48
Metoda firmy Celera Genomics sekwencjonowania
genomu
49
Plan

• Kontigi i rusztowania.
• Dwie strategie asemblacji genomu (WGA, CSA).
• Poszukiwanie genów.
• Analiza genomu.
• Porównanie sekwencji Konsorcjum i Celery.

50
Celera

• 3,000 m.kw.
• 175,000 reakcji sekwencjonowania na dzien.
• Wirtualna Farma Obliczeniowa (Compaq Alpha)
• 440 CPU (EV6 (400MHz), EV67(667MHz)).
• Kazdy 2-8GB RAM.
• 100TB HD.

51
Dane do obróbki

• Biblioteka plazmidów (rozmiarów 2Kb, 10Kb, 50Kb).
• Konstrukcja stowarzyszonych par (mate pairs)
  sekwencje 500-600bp, z kazdego konca sekwencji z
  biblioteki plazmidów (27.27 milionów odczytów).
• Kontigi zbudowane z BACów dostepnych z
  publicznych danych Konsorcjum (4.4Gb).

52
Kontigi, rusztowania i stowarzyszone pary
53
(No Transcript)
54
Dwie strategie asemblacji genomu

• Whole-genome assembly (WGA).
• Compartmentalized shotgun assembly (CSA).

55
Asemblacja WGA

• Analiza nakryc (overlaps) 10,000h czasu CPU, 40
  komputerów (4-procesorowy Alpha), 4GB RAM kazdy.
  Równoleglosc.
• Wybór jednoznacznych kontigów (unitigi) 73.6
  genomu.
• Wykorzystanie par stowarzyszonych do budowy
  rusztowan (scaffolds).
• Uzupelnianie dziur w rusztowaniach (fazy rocks
  oraz stones).

56
Asemblacja CSA

• (Matcher) Rozdzielenie danych Celery na te,
  które pasuja do BACów z danych publicznych i na
  reszte (21 milionów odczytów pasowalo, a 3
  miliony byly nowe).

57
Asemblacja CSA, c.d.

• (Combining Assembler) Dla tych z pierwszej
  grupy, dla kazdego BACa wzieto kontigi z HGP
  oraz pasujace odczyty Celery.
• Uzyto WGA do zbudowania rusztowan (zwykle 1 lub
  2) pokrywajacych w 95 ten BAC. Asemblacja
  wysokiej jakosci.

58
Asemblacja CSA, c.d.

• (WGA) Dla drugiej grupy (nowe dane)
  przeprowadzono WGA.
• (Tiler) Analiza porzadku i nakryc dla rusztowan
  pochodzacych z BACów i z rusztowan zbudowanych
  dla nowych danych. Uzyto pary stowarzyszone dla
  klonów 50Kb i dla BACów oraz markery STS.
  Powstalo w ten sposób 3845 skladowych
  (components) obejmujacych 2.92Gb.

59
Asemblacja CSA, c.d.

• (WGAShredder) Dla kazdej ze skladowych
  zastosowano WGA, po poszatkowaniu danych na
  kawalki. Dzieki poszatkowaniu mozliwa byla
  dodatkowa korekta bledów oraz eliminacja
  fragmentów chimerycznych z danych HGP.

60
(No Transcript)
61
Ostatni krok Mapowanie rusztowan do genomu

• Do dalszej obróbki wybrano dane otrzymane z CSA.
• Wykorzystano dwie mapy fizyczne genomu mapa
  markerów STS oraz mapa linii papilarnych BACów.
• W ten sposób wiekszosc rusztowan zostala
  przyporzadkowna pozycjom w genomie (98 genomu).
  Powstalo 21,600 przerw pomiedzy rusztowaniami.

62
Analiza genomu (wg. Celery)

• Poszukiwanie genów.
• Wstepny opis chromosomów.
• Korelacja gestosci genów z innymi wielkosciami.
• Rozklad genów wg. molekularnej funkcji.
• Duplikacje genomu w skali makro.

63
Poszukiwanie genów

• System ekspercki Otto - symulacja czynnosci
  wykonywanych przez czlowieka opisujacego
  chromosomy. Otto wykryl 6538 genów homologicznych
  do znanych genów oraz 11,226 nowych fragmentów
  podejrzanych o bycie genem. Lacznie 17,764 geny.

64
Poszukiwanie genów, c.d.

• Oprócz Otto uzyto trzech programów odgadujacych
  geny GRAIL, Genescan, FgenesH. Zrobily one
  lacznie 76,410 róznych predykcji, z czego 57,935
  predykcji nie pokrywalo sie z predykcjami Otto.
• Dodatkowy filtr co najmniej jedno potwierdzenie
  z nastepujacej listy.

65
Cztery typy potwierdzen dla predykcji genów

• Homologia ze znanym bialkiem.
• Zawieranie ludzkiego EST.
• Zawieranie EST gryzonia.
• Wystepowanie w genomie myszy.

66
Ile jest genów?

• Biorac wszystkie predykcje Otto oraz predykcje
  w/w trzech programów spelniajace dodatkowo
  warunek
• Co najmniej 1 potwierdzenie 39,114 genów
• Co najmniej 2 potwierdzenia 26,383 geny.
• Co najmniej 3 potwierdzenia 23,000 genów.

67
Wstepny opis Celery chromosomów
Chr. 1 Chr. 19 Chr. 21 Chr. 22 Chr. X Chr. Y
68
Chromosomy 11, 12, 13 Korelacja gestosci genów Z
innymi wielkosciami
69
Rozklad 26,383 genów wg. molekularnej funkcji
70
Duplikacje wzgledem chromosomu 1
71
Duplikacje wzgledem chromosomu 6
72
Duplikacje wzgledem chromosomu 19 rekordowo duzo
73
Duplikacje wzgledem chromosomu 22 rekordowo malo
74
Porównanie sekwencji HGP i Celery

• Praca J. Aach, et.al. Computational comparison
  of two draft sequences of the human genome.,
  Nature, 409, 15.02.2001, (856-859).
• HGP-nr (2.9Gb).
• Cel Celera Genomics (Human Genome D, 2.9Gb).

75
(No Transcript)
76
(No Transcript)
77
Porównania wykonane przez Celere

• Zielony kolor sekwencje Celery sa w tej samej
  orientacji i kolejnosci w obu sekwencjach.
• Zólty kolor sekwencje Celery sa w tej samej
  orientacji, ale nie w tej samej kolejnosci w obu
  sekwencjach.
• Czerwony kolor sekwencje Celery nie sa w tej
  samej orientacji w obu sekwencjach.

78
Porównania wykonane przez Celere, c.d.

• Górna czesc wykresu Konsorcjum (2K, 10K, 50K).
• Dolna Celera (2K, 10K, 50K).
• Seledynowe kreski przerwa co najmniej 10.000b.
• Stowarzyszone pary (niezgodnosci)
• Czerwony zla orientacja.
• Zólty zla odleglosc pomiedzy koncami.
• Niebieskie kreski zlamania (breakpoint)

79
Porównanie dla chromosomu 21
80
Porównanie dla chromosomu 22
81
Porównanie dla chromosomu 19
82
Porównanie dla chromosomu 8
83
Przerwy i zlamania w obu sekwencjach

• Górna czesc Konsorcjum.
• Dolna czesc Celera.
• Czerwona kreska przerwa co najmniej 10Kb.
• Niebieska kreska zlamanie (breakpoint)
  sprzecznosc z co najmniej 5 stowarzyszonymi
  parami.

84
(No Transcript)