Diapositiva 1

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Liberación regulada de L13a desde la subunidad
ribosomal 60s como un mecanismo de control
traduccional transcripto-específico.
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Objetivos
Evidenciar un mecanismo de silenciamiento
traduccional que implica la liberación de una
proteína integral ribosomal. Proponiendo así, un
modelo en el cual el ribosoma es visto como un
depósito de proteínas reguladoras, aparte de su
rol como maquinaria de síntesis proteica.
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Introducción
Ceruloplasmina (Cp) proteína de la fase aguda
sintetizada en el plasma por los hepatocitos y en
zonas de inflamación por medio de los macrófagos
estimulados por citoquinas. Cada molécula
contiene de 6 a 7 átomos de cobre, los cuales le
otorgan las funciones oxidativas a la proteína,
como por ejemplo facilitar la captación del
hierro por parte de la transferrina. Esto le da
un importante rol en la regulación de la
homeostasis del plasma. La función de la Cp
derivada de macrófagos está menos clara. Podría
estar involucrada en actividad bactericida,
debida posiblemente al daño oxidativo causado por
Cp.
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Interferón gamma induce el ARNm de Cp y su
expresión en monocitos de las células U937 (línea
celular humana) y en monocitos de la sangre
periférica. Cp está sujeta a un mecanismo de
silenciamiento traduccional. Elemento GAIT
Inhibidor traduccional activado por interferón ?
en la región Cp 3UTR (untraslated region) del
ARNm es necesario para el silenciamiento de la
traducción de Cp. Proteína GAIT Proteína de
unión a GAIT, que bloquea el inicio de la
traducción.
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Se identificó una proteína citosólica en las
células U937 tratadas con interferón gamma que se
une específicamente al elemento GAIT proteína
L13. En base a estos resultados se propone un
mecanismo de control traduccional en el cual el
ARNm de Cp se circulariza y permite la unión de
la proteína GAIT bloqueando la iniciación de la
traducción. Además se observó que el interferón
gamma induce la fosforilación de L13a, lo que
causa su liberación desde la subunidad grande
ribosomal. Uniéndose luego al elemento GAIT en la
región Cp3UTR y dando como resultado el
silenciamiento traduccional del ARNm de Cp.
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Resultados Identificación de la proteína
ribosomal L13a como un candidato a GAIT.
Método de triple híbrido en levadura Es una
técnica de biología molecular que se usa para
detectar interacciones entre ARN y proteína.
Muchos factores de transcripción en eucariotas
poseen al menos dos dominios funcionales
distintos, uno de ellos reconoce UAS (upstream
activation sequence) y otro promueve la
maquinaria de transcripción.
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MS2 coat protein
Presa
Los dominios son separados, el dominio de
activación (B42) se recombina a la proteína de
unión al ARN de interés (presa), mientras que el
dominio de unión al ADN (LexA) se recombina a una
proteína de unión a ARN (MS2 coat
protein). También se fabrica un Cebo, que es un
hibrido de ARN, que contendrá la secuencia GAIT
(a la que queremos unir la presa) recombinada con
ARN MS2 (al que se unirá la proteína de unión
MS2).
Híbrido de ARN ( ARNMS2 - ARNGAIT )?
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La unión de un hibrido de ARN a cada una de las
dos proteínas quiméricas activa la transcripción
de un gen reportero in vivo, en este caso el His
3.
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Las levaduras fueron cotransfectadas con los
siguientes plasmidos
Proteína quimérica (presa)?
La presa estaba contenida en una librería de
ADNc proveniente de celulas U937 monociticas
activadas con interferón ? en tendem con el
dominio de activacion B42. ADNc- A partir de
todo el pool ARNm
ADNc
Dominio de activacion B42
Híbrido de ARN (cebo)?
Híbrido de ARN (cebo)?
Como cebo se utiliza un hibrido de ARN de la
extension Cp 3 - UTR recombinado con ARN de MS2.
3UTR- Cp
3UTR- Cp
MS2
MS2
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Proteína quimérica
MS2 coat protein
La proteina MS2 coat protein corresponde a una
proteina de cubierta de virus que se une al ARN.
Lex A es la proteína de reconocimeinto al ADN.
Lex A
Factor de transcripción
Factor de transcripción
UAS (Upstream activating sequence)?
UAS (Upstream activating sequence)?
El Gen reportero HIS3 codifica la enzima
necesaria para la levadura auxótrofa de histidina
y le permite reproducirse en un medio desprovisto
de histidina. Cepas AUXOTROFAS - Requieren
Factores de Crecimiento ej un aminoácido
His 3 (Gen reportero)?
His 3 (Gen reportero)?
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Selección de Cepas recombinantes
106 clones de levadura
Se rastrearon 106 clones de levadura en un medio
deficiente en Histidina de los cuales en primer
lugar solo 103 fueron clones tuvieron crecimiento
en este medio, mostrando expresion del gen
reportero.
Medio deficiente en Histidina.
Para asegurar que la transcripción de His 3 es
dependiente de la presencia del elemento GAIT (Cp
3- UTR) se hace una segunda selección con 5FOA,
el cual causa el rechazo al plásmido que contiene
el cebo. Entonces los clones que dependan de la
presencia del cebo de ARN no podrán crecer en un
medio deficiente en Histidina con 5-FOA. La
secuenciación de estos clones identificó 15
sensibles a 5-FOA que contienen ORFs en Fase con
el dominio de activación de B42.
103 clones tuvieron crecimiento en este medio
5- fluoroorotic acid (5- FOA)
Secuenciación
15 clones
12
15 clones
Estos clones fueron replicados en un medio rico
en uracilo para sacar los plásmidos que
contienen el cebo y URA3, con el fin de expresar
la presa de unión a ARN en su forma libre.
Medio que contiene uracilo
Expresión de la presa en forma libre
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• Objetivo Ensayar el silenciamiento de la
  actividad traduccional, habilidad de lisados de
  inhibir traducción.
• cARN (Luc-Cp 3 UTR) sujeto a traducción in vitro
  conteniendo 35S metionina en presencia de
  extractos citosólicos de los clones
  seleccionados.
• Alícuotas de la reacción de traducción fueron
  sujetas a SDS PAGE y autoradiografía.
• Como control se usa T7 gen 10 cRNA que no posee
  elemento GAIT.

Se observa una banda de menor intensidad
correspondiente al clon ORF2, esto corresponde a
una menor cantidad de producto de traducción
(Luc). Concluyendo que solo el clon ORF2 inhibe
la traducción del transcripto reportero quimérico
(Luc-Cp 3 UTR) pero no altera la traducción del
transcripto control.
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Objetivos Mostrar interacción de ORF2 con Cp
3-UTR.

• Lisado del clon ORF2 sujeto a un EMSA usando como
  sonda Cp 3UTR radio marcada.

• Para los experimentos de competición los lisados
  fueron preencubados con un exceso
• de elemento GAIT o con un mutante de Cp 3UTR .

La presencia de banda en el carril 2 sugiere la
formación del complejo ARN- Proteína entre la
sonda y el ORF2. La ausencia de banda en el
carril 3 muestra que la proteína ORF2 tiene
especificidad de unión a elementos GAIT. Se une
a la sonda pero también se une al elemento GAIT
competidor, por esto se visualiza una menor
intensidad de banda. En el
carril 4, se observa formación del
complejo, indicando que ORF2 tiene
especificidad de unión para la sonda y no para
un mutante de esta.

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• Objetivo Verificar que los resultados obtenidos
  se deban al plásmido presente en ORF2, y no a una
  alteración secundaria o a una mutación en el clon
  de la levadura.
• Recuperación del plásmido de ORF2 y
  retransformación en levaduras con el cebo (bailt).

Las levaduras transfectadas con los vectores
conteniendo ORF2 y Cp3UTR (50-150) crecieron en
un medio sin histidina. Mientras que aquellas que
carecian del cebo o de la presa, no crecieron en
un medio sin histidina (figura del medio). Todas
las levaduras transformantes crecieron en un
medio con histidina (figura de la derecha).
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Secuenciación del ADN plasmídico de ORF2 (Fig.
D) codifica para la proteína ribosomal humana
L13a, proteína integral de la subunidad ribosomal
grande, de 23 KDa con 202 aminoácidos. Dos
motivos consenso han sido descriptos en L13a
(Fig. E) el leucine zipper y el dominio
básico del leucine zipper.
Parecería ser que L13a no tiene un rol directo en
la formación de las proteínas nacientes desde el
ribosoma.
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El L13a se une a Cp 3-UTR en las células y es
requerido para el silenciamiento de la actividad
traduccional.
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Se realiza un Ensayo EMSA supershif ARN para
comprobar que la proteína L13a se encuentra
enlazada al elemento GAIT.
Células U937 fueron tratadas con INF-? por 8 y
24 horas. Extractos citosólicos resultantes del
tratamiento con INF- ? fueron incubados con radio
marcadores del elemento GAIT. Para confirmar la
presencia de la proteína L13a extractos tratados
por 24hrs. fueron pre incubados con anticuerpo
anti-L13a polyclonal o con suero pre inmune.
El ensayo EMSA demuestra que una proteína
enlazada al elemento GAIT (marcado) forma
complejo ARN-Proteína sólo luego de 24hrs de
tratamiento con INF-?. El supershift con el
anticuerpo anti-L13a confirma que la proteína es
la L13a.
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Se testea la habilidad de la proteína L13a en la
activación o inhibición dela traducción de un
transcripto reportero .
Se intentó comprobar si la actividad traduccional
del transcripto de ARN reportero que contiene al
elemento GAIT, Luc-Cp 3-UTR (50-150)-poly(A),es
silenciada o no por la proteína L13a. Para ello,
extractos citosólicos de células U937 se
trataron con INF- ? por 8 y 24hrs. Los
extractos de 24hrs se sometieron a una
Inmunosupresión para remover la proteína L13a con
el anticuerpo anti-L13a o suero pre inmune como
control. Se adicionó también como control de
especificidad un transcripto de ARN diferente, el
T7 gen 10, que no tiene el elemento GAIT.
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Como resultado del ensayo de actividad
traduccional in vitro podemos observar que

• En los primeros dos carriles con y sin
  tratamiento de INF-? durante 8 hrs hay actividad
  traduccional.
• En el primer carril de extractos tratados por
  24hrs con INF-? no hay actividad, sugiriendo que
  el L13a se unió al elemento GAIT incluido en
  transcripto reportero silenciando la actividad
  traduccional.
• En el siguiente carril, con el agregado del
  anticuerpo anti-L13a, se procedió a la
  inmunosupresión sacando el L13a del camino por
  lo que se detectó actividad traduccional.
• En el último carril con suero pre-inmune, sin
  anticuerpo, no se observa marcado sugiriendo el
  silenciado de la actividad traduccional.

La remoción de L13a por inmuno-supresión demostró
la habilidad de la proteína para silenciar la
actividad traduccional de las células U937
tratadas por 24hrs con INF-?.
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Se investigó la interacción in vivo entre L13a y
ARNm Cp en células U937
Células U937 fueron tratadas con INF-? por 8 y
24hrs, de los extractos citosólicos la proteína
L13a fue inmuno-precipitada (IP) con anticuerpo
anti-L13a y el producto obtenido fue amplificado
por PCR-RT. El objetivo de este ensayo es
demostrar la existencia de un enlace intracelular
de L13a con el Cp ARNm de éstas células.
Estos resultados demuestran que L13a es enlazada
específicamente, y en forma retrasada, al Cp
3UTR de células U937 tratadas con INF-?.
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El L13a recombinante tiene actividad silenciadora
de la traducción.
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La expresión de L13a recombinante(rL13a) en
E.Coli y en células de insectos fue testeada por
análisis de inmunoblot.
La rL13a fue testeada en células E.Coli y células
de insectos infectadas con baculovirus y
parcialmente purificadas por cromatografía en gel
filtración. Como vector control (C) se usa ORF
de L13a humano clonado en un vector pET-17b.
Ambos sistemas expresaron cantidades sustanciales
de proteína recombinante pero las proteína
derivadas de células de insectos tuvieron una
movilidad retardada levemente comparadas con las
células de E. Coli sugiriendo una posible
modificación post-traduccional para las células
de insectos.
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La habilidad de rL13a es testeada también por
traducción in vitro en células U937, E. Coli y
células de insectos.
Como control de especificidad se utilizó el gen
T7 gen 10. Como control positivo del silenciado
de actividad traduccional se utilizaron lisados
citosólicos de células U937 tratadas con INF-?
por 24hrs.

• En células E. Coli se detectó un marcado
  sustancial en ambos carriles (C y L13a)
  sugiriendo que L13a de dichas células no afecta
  la traducción del transcripto reportero quimero
  Luc.
• En células de insectos se detecta banda en el
  vector C pero no en el vector con L13a sugiriendo
  que L13a derivado de dichas células inhiben la
  traducción del transcripto reportero . De igual
  manera sucede con en extractos de células U937
  tratadas por 24hrs con INF-?.
• La actividad silenciada de rL13a fue específica y
  no bloqueó la traducción sobre el transcripto
  control T7 gen 10.

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EL INF-? causa la fosforilación retardada del
L13a en células U937
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Método de Nothern Blot Es un método análogo al
Southern Blot, para estudiar la expresión de
genes por detección de uno o mas ARNm específicos
en una muestra total de ARN. El ARN es
desnaturalizado, separado por tamaño por
electroforesis y transferido a una membrana de
nylon donde es hibridizado y detectado con una
sonda marcada de ADN o ARN complementaria.
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• Objetivo examinar efecto del interferón ? en
  la expresión de L13a
• ARN fue separado de células U937 incubadas con
  interferón ? 0, 8 y 24hs.
• Sujeto a Nothern Blot usando ADNc de L13a
  humana como sonda.

Conclusión El interferón ? no altera el nivel de
ARN de L13a durante el período de tratamiento.
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Método de Westernblot (Protein inmuno Blot) Es
una técnica analítica usada para detectar
proteínas especificas en un extracto. Se usa
una electroforesis en gel para separar las
proteínas. Estas son transferidas a una membrana
de nitrocelulosa o PVDF donde son detectadas
usando anticuerpos específicos para la proteína
objetivo.
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• Objetivo examinar la regulación
  post-transcripcional
• Extractos de células U937 tratadas con interferón
  ? sujetos a SDS-Page
• Realización de Inmunoblot con anticuerpos
  anti-L13a

Conclusión El tratamiento con interferón ? no
altera significativamente el nivel de expresión
de L13a. Sin embargo si modifica su movilidad,
que es marcadamente disminuida luego del
tratamiento por 24 hs, sugiriendo una
modificacion post traduccional.
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Immunoprecipitación (IP) Es una técnica de
precipitación de proteína usando un anticuerpo.
Este proceso puede ser usado para separar o
concentrar una proteína particular de una
muestra. La inmunoprecipitación requiere que el
anticuerpo se una a un sustrato solido en algún
punto del procedimiento. El principio de la IP
es muy simple, un anticuerpo mono o polyclonal
contra un objetivo especifico forma un complejo
inmune con la proteína objetivo en una muestra
como un lisado. El complejo se une a un soporte
solido donde una proteína A o G están
inmovilizadas y hacen al complejo insoluble que
por tanto precipita.
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Suero pre-inmune

• Objetivo examinar la posibilidad de que la
  fosforilación de L13a cause el retardo en la
  movilidad electroforética.
• Marcado metabólico con puso de 6hs de
  32P-ortofostato
• Realización de Inmunoprecipitación con
  anticuerpos anti-L13a
• Separación por SDS-PAGE
• Auto radiografía

Proteína L13a Fosforilada
Conclusión El L13a fue fosforilado en un curso
de tiempo consistente con el retardo de la
movilidad.
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• Objetivo Determinar el rol de la fosforilación,
  efecto del tratamiento con fosfatasa en la
  actividad de L13a.
• Células U937 tratadas con interferón ? fueron
  incubadas en fosfatasa alcalina.
• Realización de Inmunoblot con anticuerpos
  anti-L13a

Conclusión Muestra que la fosfatasa alcalina
restaura la movilidad electroforética del L13a,
indicando que el retardo era debido a la
fosforilación y mostrando también la efectividad
del tratamiento.
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• Traducción in vitro del reportero Luc-Cp
  3UTR-polyA en lisados de reticulocito de ratón
  tratados con interferón ?.

Conclusión El lisado con fosforilasa no inhibe
la traducción in vitro del reportero indicando el
rol critico de la fosforilación de L13a en el
silenciamiento de la traducción.
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• Objetivo Confirmar rol de L13a en la actividad
  de silenciamiento traduccional fue debido a
  fosforilación diferencial, se usan proteínas
  recombinantes de L13a de 2 fuentes.
• Marcado metabólico con 32P-ortofostato
• Realización de Inmunoprecipitación con
  anticuerpos anti-L13a
• Separación por SDS-PAGE
• Auto radiografía

Proteína L13a Fosforilada
Conclusión El L13 derivado de células de
insectos fue fosforilado y era activo, mientras
que el L13 de E.coli estaba sin modificar y era
inactivo.
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• L13a recombinante construida por células de
  insectos infectadas con baculovirus son tratadas
  con fosfatasa alcalina en presencia o ausencia de
  inhibidor
• L13 a es adicionado a la mezcla de traducción
• Traducción in vitro del reportero Luc-Cp
  3UTR-polyA en lisados de reticulocito de ratón
  tratados con interferón ?.

Conclusión El tratamiento con L13a derivado de
células de insecto con fosfatasa alcalina bloquea
la actividad silenciadora.
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Conclusión General Los resultados muestran que
TODO el pool de L13a de las células U937 es
fosforilado luego de un tratamiento prolongado
con interferón ? y esa modificacion es requerida
para el silenciamiento de la traducción.
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El INF-? induce la liberación del L13a de la
subunidad ribosomal 60S
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Objetivo Buscar cual es la forma en la que L13a
se encuentra al enlazar al transcripto, ribosomal
(unida a la subunidad ribosomal 60S) o citosólica
(no ribosomal)

• A y B
• Lisados de células U937 tratados con INF-?
  fueron fraccionados sobre un cojín de azúcar
  para separar la fracción ribosomal del citosol
  libre de ribosomas.
• Ambas fracciones fueron sujetadas a SDS-PAGE y
  análisis de inmunoblot con anticuerpos anti-L13a
  y anti-L28 para A y B respectivamente.

Conclusión de A y B L13a se enlaza al transcripto
encontrándose en su forma citosólica
C- De las fracciones ribosómicas y citosólicas se
extrajo el ARN y se visualizó con bromuro de
Etidio sobre un gel de agarosa-formaldehído.
Conclusión de C La ausencia de ARN ribosomal 28S
y 18S verifica que en los procedimientos A y B se
removieron eficientemente todas las subunidades
ribosómicas intactas.
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Discusión El INF-? induce la liberación de
L13a desde la subunidad ribosomal
39
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• Entre las 2 y 4 hrs. luego del tratamiento con
  interferón ? en células U937
• Cp ARNm es inducido y comienza su traducción.
• L13a esta en la subunidad ribosomal
• 60S en su forma no fosforilada.

• Entre las 16 y 24 hrs
• L13a esta fosforilada y libre del ribosoma. Esto
  se puede dar de dos maneras posibles
• L13a se fosforila estando unida al ribosoma, lo
  que causa su liberación.
• L13a se disocia del ribosoma y luego es
  fosforilada.

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• A las 24 hrs
• L13a libre y fosforilada se une al elemento GAIT
  Cp 3UTR.
• El silenciamiento requiere de la circularización
  del ARNm,
• o más precisamente, de los elementos requeridos
  para la
• terminación de la transcripción cola de poly(A),
  
• PABP (factor de iniciación de la traducción,
  proteína de unión a poly(A)), elF4G (proteína de
  unión-cap).

Se propone que una función de la circularización
sería yuxtaponer las proteínas de unión a 3UTR
con el sitio de iniciación 5donde se podría
ejercer control de la traducción.
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4 posibilidades pueden ser consideradas para
explicar el mecanismo por el cual GAIT bloquea la
iniciación de la traducción.

• GAIT podría
• Inhibir la función del complejo de unión cap,
  elF4G
• Bloquear el reclutamiento del complejo de
  preiniciación 43S
• Prevenir el rastreo del complejo 43S al codón de
  iniciación
• Bloquear la unión de la subunidad ribosomal 60S

La función específica de la fosforilación de L13a
no se conoce, pero podría facilitar la unión al
elemento GAIT , tanto directamente o por la unión
de otras proteínas en un complejo de unión al
elemento GAIT.
43
El ribosoma como Depósito para Proteínas de
Control Traduccional
44

• La liberación de varias proteínas ribosomales
  desde el ribosoma influye en la traducción de
  proteínas específicas (o sobre un grupo de
  proteínas), sin alterar la síntesis general del
  resto de proteínas.
• L13a actúa de esa forma las células U937
  tratadas con INF-? por 24 hrs. no inhiben la
  síntesis global de proteínas.
• Estudios con Cristalografía de rayos X de la
  subunidad ribosomal 50S de Haloarcula marismortui
  (bacteria) muestran que la mayoría de la masa
  proteica se encuentra como un dominio globular
  discreto sobre la superficie del núcleo del ARN,
  lejos del sitio de catálisis.

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Visualización por Cristalografía de rayos X de la
subunidad ribosomal 50S con la proteína L13 de
Haloarcula marismortui (bacteria), análoga a la
proteína L13a de eucariotas.
Relación de L13 (proteína globular superficial de
la subunidad 50S) con otras proteínas ribosomales
y con el ARN.
El ARN está representado como hebras para revelar
las proteínas en el interior de la subunidad 50S.
No se ve ningún dominio de L13 sumergido,
mostrando que se encuentra enteramente en la
superficie.
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L13 tiene un mínimo contacto con los dominios de
la proteínas de superficie L3 y L6.
La remoción de L13 del modelo expone una
depresión en la superficie del ARN y muestra que
L13 no interactúa con ninguna proteína de las
enterradas.
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• Se piensa que la unión de las proteínas al ARN
  depende de la topología superficial del ARN y no
  de la especificidad en las secuencias de ARN.
• L13 esta lejos de los sitios de elongación de
  cadenas y salida de polipéptidos, esto apoya su
  no influencia en la síntesis de proteínas
  globales.
• La estructura y posición de L13 disminuye las
  dificultades para su liberación desde el
  ribosoma.
• Se sabe poco acerca de la estructura y función de
  L13a en la subunidad 60S de eucariotas. Análisis
  en Saccharomyces cerevisiae (levadura) del
  ribosoma 80S sugiere que su proteína L16
  ribosomal análoga a la L13a de vertebrados, está
  localizada en la superficie del ribosoma.

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Resumiendo

• Además de funcionar como maquinaría de la
  síntesis proteica, el ribosoma actúa como un
  depósito para las proteínas de regulación
  traduccional.
• La función del retrazo en el silenciamiento de la
  traducción de Cp no es conocida. Una posibilidad
  es sugerida por el hallazgo de que la actividad
  bactericida de Cp es efectiva solamente en un
  escaso margen de concentración. Alternativamente,
  la acumulación incontrolada de Cp en los sitios
  de inflamación podría traer consecuencias
  perjudiciales relacionadas con la habilidad del
  cobre de Cp para oxidar lipoproteínas.
• El mecanismo de silenciamiento de la traducción
  podría haber evolucionado para terminar o limitar
  la expresión de Cp por parte de los macrófagos y
  de otras proteínas inflamatorias.
• Varios mecanismos conocidos en la terminación de
  la inflamación, implican el control traduccional.