DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTE

1
DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS
Lucía Pérez Coello
ESCIVE 2009
2
A alumna Lucía Pérez Coello, de 2º de bacharelato
do I. E. S. Otero Pedrayo de Ourense, estivo
durante o verán do 2009 no IBCM (Instituto de
Bioloxía Celular e Molecular de Oporto),
participando no programa Estancias Científicas
(ESCIVE), organizadas en España pola Fundación
Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT).
A CONTINUACIÓN PRESÉNTANOS O TRABALLO
DESENVOLVIDO DESPOIS DA SÚA ESTANCIA.
3
ESCIVE

• OBJETIVO impulsar el contacto de jóvenes de
  entre 15 y 17 años con el trabajo cotidiano en
  centros y departamentos de investigación
  españoles y portugueses.

4
IBMC
http//www.youtube.com/watch?vcehkhV6AIlAfeature
player_embedded
5
InstitutoBiologíaMolecularCelular
MECANISMOS DE ADAPTACIÓN CELULAR
SEÑAL E IMAGEN
BIOMATERIALES
BIOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL
BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN E INMUNOLOGÍA
GENÉTICA HUMANA Y DOLENCIAS GENÉTICAS
NEUROBIOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA
6
Descubriendo la estructura de las proteínas
ESCIVE Ciencia Viva 2009

• Lucía Pérez Coello
• Felipe Demígio Fernandes Pereira

7
Objetivo

• Estudiar la estructura de las proteínas
• Comprender su función
• Determinar los mecanismos de funcionamiento e
  interacción con otras moléculas.

8
Lisozima

• Enzima
• Estructura tridimensional determinada por
  primera vez por David Phillips, en 1965.
• Se encuentra en las lágrimas, saliva y moco
  humanos.
• Producida por varios organismos.
• Destruye la pared celular de las bacterias.

Estrutura primária da Lisozima
9
Pasos para determinar estructuras de proteínas
10
1. Producción de proteínas

• Clonación
• Expresión (Escherichia coli)
• Purificación

• Filtración en gel
• Intercambio iónico
• Afinidad

Cromatografia
11
2. Cristalización
Las proteínas, como muchas moléculas, pueden ser
llevadas a formar cristales cuando son colocadas
en condiciones apropriadas. Para que cristalice,
la proteína purificada es sometida a una
precipitación lenta a partir de una disolución
acuosa.
MEJORA DE LOS CRISTALES
ENSAIOS DE CRISTALIZACIÓN
CONDICIONES DE CRISTALIZACIÓN
OPTIMIZACIÓN
12
Métodos de cristalización

• Gota colgante
• Gota sentada

• Diálisis
• Difusión en gel

13
Diagram of hanging drop method. Reservoir
solution (blue) usually contains buffer and
precipitant. Protein solution (red) contains the
same compounds, but in lower concentrations. The
protein solution may also contain trace metals or
ions necessary for precipitation of particular
proteins (McRee, 1993).
14
(No Transcript)
15

• Preparamos 3 disoluciones (de concentraciones
  diferentes) que contengan Lisozima en 0,1 M NaAc
  pH 4.8
• Disolución reservorio 1 ml de 10 (m/v) NaCl,
  0,1 M NaAc pH 4,8 e 25 (v/v) Etilenoglicol
• La gota de la lámina contiene 6-7 ?L de
  disolución de Lisozima y 4-3 ?L de disolución
  reservorio (volumen total de 10 ?L)

30 mg/mL
20 mg/mL
10 mg/mL

• Ponemos las láminas sobre los pozos y los
  sellamos con silicona
• Los cristales deben crecer dentro de 1-2 días y
  estar preparados para enfriamiento criogénico.

(?L)
  1   2   3   4   5   6
A            
   
B            
   
C            
   
D            
                       
82
73
64
55
16
(No Transcript)
17
(No Transcript)
18
NUESTROS CRISTALES
19
(No Transcript)
20
(No Transcript)
21
(No Transcript)
22
(No Transcript)
23
(No Transcript)
24
(No Transcript)
25
Próximos pasos
http//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/73
/X_ray_diffraction.png
26
Se obtiene una muestra y se somete a enfriamiento
criogénico para evitar que se desestabilice.
27
Difractómetro
28
Montaje del cristal
29
3. Difracción
30
Ley de Bragg n?? 2d sin ?
31
Construyendo el modelo
Los mapas de densidad electrónica son el
resultado final del experimento de difracción. Su
interpretación en términos de un modelo molecular
es la primer tarea del cristalográfo.
32
(No Transcript)
33
Estructuras en 3D Lysozyme
34
(No Transcript)
35
http//lysozyme.co.uk/lysozyme-structure.php
36
(No Transcript)
37
Presentación del trabajo realizado
38
(No Transcript)
39
FIN