Princip prutokov

1
Prutoková cytometrie

• Princip prutokové cytometrie
• Použití více fluorescencních barev - teorie
  kompenzace
• Možnosti analýzy dat
• Nekteré aplikace prutokové cytometrie

Imunologické laboratorní metody 12.4.2010
2
Prutokový cytometr Automatický mikroskop

• Prutoková cytometrie je technologie, která
  umožnuje simultánní merení nekolika
  charakteristik na úrovni jedné bunky

Detekce Pocítání
Bunky prochází pred objektivem mikroskopu a je
automaticky zmerena jejich fluorescence. Nevýhody
oproti mikroskopii nevíme, kde je v bunce signál
lokalizován
Odpad
Vzorek
3
Složky prutokového cytometru
Fluidika vzorek bunecná suspenze. Nasátí
vzorku do prístroje. Prutok vzorku prístrojem.
Vytvorení proudu bunek pro merení. Sortování.
Regulace rychlosti merení. Optika Zdroj
excitacního zárení. Optické zarízení pro sber
emitovaného zárení a odraženého svetla. Zdroje
svetla (lasery, detektory, filtry) Elektronika
Prevod optického signálu na elektronický signál.
Digitalizace pro pocítacovou analýzu. Analýza
dat Zobrazení dat analýza identifikace
populací kvantifikace intenzity
znacení kvantifikace zastoupení bunek v dané
populaci
4
Schéma fluidiky
vzorek
5
Princip prutokové cytometrie
Jádro prutokového cytometru Flow cell - kyveta
Nasátí bunek
Velikost otvoru v nozzle 50 to 400 µm - na
nekterých prístrojích lze menit
6
Hydrodynamická fokusace v kyvete
Dobré rozlišení
Horší rozlišení
Vzorek
Vzorek
Unášecí tekutina
Unášecí tekutina
Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorku Vhodné pro
DNA analýzu
Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku. Nevhodné
pro DNA analýzu
7
Rozptyl svetla bunkouForward Scatter (FSC)
Cím vetší bunka, tím vetší rozptyl svetla FSC
závisí na velikosti bunky
8
Rozptyl svetla bunkouSide Scatter (SSC)
Intenzita SSC je proporcionální množství
cytosolických struktur v bunce (granula, bunecné
inkluze, atd.) SSC závisí na granularite bunky
9
Rozdelení krevních bunek dle FSC a SSC
10
Detekce fluorescence, znacení protilátkami
11
Intenzita fluorescence
Pocet bunek
101
104
103
102
Relativní intenzita fluorescence
12
Fluorescencní kanály

• Fluorochromy (bunce vlastní nebo navázané, napr.
  pomocí protilátek) na bunkách absorbují cást
  svetla a excitují se
• Emise svetla o nižší energii, tj. o delší vlnové
  délce než byla excitacní.
• Emitované fotony prochází pres sberné cocky a
  jsou pomocí soustavy filtru a zrcadel rozdeleny
  do kanálu dle svojí vlnové délky

Stokesuv posun
13
LaseryLight amplification by stimulated emission
of radiation

• Zdroj monochromatického svetla (jediná vlnová
  délka)
• Zdroj koherentního vlnení vlnení o stejné
  frekvenci, stejného smeru kmitání a stejné fáze
  (nebo se stejným fázovým rozdílem).
• Stabilní zdroj zárení

Lasery v prutokovém cytometru Dvoulaserové
prutokové cytometry argon laser - modrý (488
nm) helium-neon diode laser - cervený (633 nm).
Trílaserové prutokové cytometry violet laser -
fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)
14
Detekce Fluorescence
Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtru a
cocek rozdelena podle vlnové délky do kanálu. Na
koncových detektorech je v každém z nich
vyhodnocena intenzita fluorescence.
15
Intenzita fluorescence
Number of Events
101
104
103
102
Relative fluorescence intensity
16
Long Pass Filtry (LP)

• Propouští všechny vlnové délky vyšší než
  specifikovaná vlnová délka
• Example 500LP bude propouštet všechny vlnové
  délky vetší než 500nm

17
Short Pass Filtry (SP)

• Propouští všechny vlnové délky kratší než
  specifikovaná vlnová délka
• Príklad 600SP bude propouštet všechny vlnové
  délky kratší než 500nm.

18
Pásmové filtry

• Propouší specifické rozmezí vlnových délek
• Príklad 550/20BP Filter bude propouštet vlnové
  délky mezi 540nm a 560nm (550/20 550/-10, ne
  550/-20)

19
Dichroické filtry

• Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP)
• Filtr je umísten v úhlu 45
• Cást svetla je odražena v úhlu 90º k príchozímu
  paprsku, cást svetla je propuštena.

20
Jednoduché schéma optiky prístroje
Pocet kanálu 2 lasery obvykle 4 kanály 3
lasery až 11 kanálu
FITC
PE
APC
PC5
21
(No Transcript)
22
Vícebarevná prutoková cytometrieFACS Aria
23
Vícebarevná prutoková cytometrie
24
Elektronika

• Detektory PMT (photomultiplier tube) elektrony
  dopadají na fotokatodu
• Lze menit napetí na PMT lze nastavit citlivost
  detektoru
• Konverze optického signálu do elektronických
  signálu (zmeny v napetí - pulsy)
• Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to
  Digital Converters ADC ).
• Analýza výšky Height (H), šírky Width (W) a
  plochy Area (A) pulsu
• Softwarová analýza dat LIST MODE FILE pro
  každou bunku hodnoty všech parametru

25
Vznik pulsu napetí na PMT
Voltage
26
Výška, šírka a plocha pulsu
Plochy pulsu (A)
Výška pulsu (H)
Napetí
40
0
cas (µs)
Šírka pulsu (W)
27
Práh (Threshold)
Hodnota treshold definuje minální intenzitu
signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno.
Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.
28
Kompenzace

• Fluorochromy typicky emitují svetlo v širokém
  spektru vlnových délek (100nm nebo víc)
• V závislosti na usporádání filtru, detektory
  mohou zachytit fluorescenci od jiných
  fluorochromu, které jsou detekovány v jiných
  kanálech kanálu (tzv. presvit, prekryv spekter)
• Presvit je treba kompenzovat, tak aby detektor
  zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu

29
Excitacní a emisní spektra fluorochromu (modrý
laser)

• Stejná excitace ruzná emise
• Prekryv spekter
• (overlap)

30
Prekryv spekter (spektral overlap)
FITC Fluorescein Isothiocyanate PE
Phycoerytrin
31
Kompenzace
Jednobarevné znacení CD8 FITC
FL2-FL112
FL2-FL10

• Jde pouze o výpocet, úpravu dat, tak aby byla
  analyzovatelná
• Závisí na
• nastavení prístroje (PMT napetí na
  detektorech)
• vlastnostech dané šarže fluorochromu

32
Kompenzace pomocí softwaru

• Je potreba pripravit jednobarevne znacené
  kontrolní vzorky
• Software vypocítá hodnoty kompenzací
• Snadné, presné a rychlé
• Umožnuje to mnohobarevnou analýzu
• Možné na cytometrech nové generace

Kompenzacní matrix
FL1 FL2 FL3
FL1 Comp 3.96 0
FL2 Comp 27.35 5.15
FL3 Comp 0 11.18
33
Mnohobarevná cytometrie

• Výhody
• Šetrí cas a vzorky
• (1) 6barevná zkumavka (15) 2barevných zkumavek
• Exponenciální nárust informace
• Data z (1) 6barevné zkumvky (15) 2barevných
  zkumavek
• Identifikace nových/málo zastoupených populací
  (lt0.05)
• interní kontroly ve vzorku
• Problémy
• Musí se peclive zvolit kombinace protilátek a
  fluorochromu
• Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech
  barvách
• Vyšší možnost vzniku chyb
• Je potreba zvolit správné kontroly

34
Analýza a interpretace dat

• Data v LIST MODE FILE pomocí speciálního
  softwaru grafické zobrazení
• Ruzné typy grafu
• Statistiky
• Názvy bežných programu (CellQuest, DiVA, Flowjo,
  WinMDI, FCS Express)

35
Histogramy zobrazení 1 parametru
Event Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 FITC Param 4 PE Param 5 APC
1 100 500 10 650 4
2 110 505 700 700 6
3 90 480 720 670 10
4 95 490 15 720 15
LIST MODE FILE
Cetnost (count)
Intenzita signálu
36
Dot ploty zobrazení 2 parametru
Periferní krev populace dle velikosti a
granularity
SSC
FSC
30
Periferní krev populace lymfocytu dle CD4 a CD8
60
37
Gatování
Populace krevních dendritických bunek

• Vytvorení statistik pro bunky,které nás zajímají
• procento pozitivních bunek
• Hodnota fluorescence
• (relativní hodnota)

Gate je definován jako oblast
Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný
subset bunek
38
Hlavní aplikace na prutokovém cytometru

• DNA a RNA analýza
• Analýza životnosti (zastoupení apopt. bunek)
• Fenotypizace (zastoupení populací, testování
  aktivace bunek)
• Funkce bunek (Ca2influx)
• Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické
  funkce)
• Sorting a bunecná izolace

39
Stanovení zastoupení základních bunecných populací
Periferní krev CD4 Th lymfocyty CD8 Tc
(cytotoxické) lymfocyty
CD16CD56 NK bunky CD19 B lymfocyty
40
Analýza životnosti, apoptózy

• Apoptóza
• fosfatidylserin na vnejší strane membrány
• vazba Annexinu V
• Mrtvé bunky
• Prunik barvy do jádra
• (PI nebo DAPI)

41
Analýza bunecného cyklu
Events
DNA obsah na prutokovém cytometru
G1
S phase
M
G0/1
G1
G2
G2/M
1
2 1
S
DNA obsah
Rozložení do fází bunecného cyklu
42
Znacení koncu DNA dUTP
Apoptóza fragmentace DNA Na volné konce DNA se
enzymaticky naváže Fluorescein-deoxyuridine
triphosphate (dUTP) Detekce v kanálu FITC
Apoptotické bunky (DNA je fragmentována
Green Fluorescence
Živé bunky (DNA není fragmentována
Green Fluorescence
43
Oxidacní reakce
Napr. Testování funkce makrofágu Oxidací vzniká
fluorescencní produkt, který je detekován
cytometricky.

• Superoxide Hydroethidine
• Hydrogen Peroxide Dichlorofluorescein
• Glutathione levels Monobromobimane
• Nitric Oxide Dichlorofluorescein

44
Influx calcia
Stimulace nespecifická, specifická
(receptory) Fluorescence barvicky pouze, pokud
váže vápník (Indo-1, Rho-2)
Flow Cytometry
Image Cytometry
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
Ratio intensity of 460nm / 405nm signals
0.3
0.2
Stimulation
0.1
Time (seconds)
0
36
72
108
144
180
Time (Seconds)
0
0
50
100
150
200
45
Testování fagocytózy

• Pohlcují dendritické bunky (DC) apoptotické
  nádorové bunky ?
• Cervene oznacené nád. bunky, DC oznacené
  protilátkou HLA-DR FITC (zelená)

24 hod
Control 0C
4 hod