PowerPoint bemutat

1
Szilárd fázisú peptidszintézispolisztirol-divinil
benzol gyantán
funkcionalizálás
elso aminosav felkapcsolása
hasítás semlegesítés
W-NH-CHR2-COOH
karboxilcsoport aktiválás
1,4-divinil-benzol
ismétlés n-szer
W-NH-CHRn-CONH-CHR1-CO
W-NH-CHRn-CONH-CHR1-CO
W-NH-CHRn-CONH-CHR1-CO
hasítás, tisztítás, stb.
2
Szükséges feltételek a sikeres szilárd fázisú
peptidszintézishez

1. Hordozó polimer1. Tartalmazzon
   funkcionalizálható reaktív rész2. A kialakított
   peptid-polimer kötés hatékonyan hasítható
   legyen3. Stabil legyen fizikai behatásokra és a
   kémiai szintézis körülményei között4. A
   növekvo peptidlánc jó hozzáférhetosége az
   oldószerek és a reagensek számára
2. Védocsoport kombináció1. A peptid-polimer kötés
   stabil legyen végig a szintézis alatt2. Átmeneti
   a-aminocsoport védelem3. A szintézis során
   stabil oldallánc védocsoportok4. A
   peptid-polimerkötés és az oldallánc védocsoportok
   egylépéses hatékony hasíthatósága
3. Reagensek1. Aktiválószerk2. Hasítóelegyek

3
Szilárd fázisú peptidszintetikus stratégiák
Két alapveto, széles körben használt stratégia a
Boc/benzil és az Fmoc/t-butil kémián alapuló
módszer.
Boc/benzil stratégia
Merrifield gyanta
A benzilészter típusú peptid-gyanta kötés nem
elegendoen stabil az ismételt savas hasításokra
és részleges hasadásuk következik be. A
Pam-típusúhandle savra sokkal ellenállóbb
peptid-gyanta kapcsolatot eredményez. PAM-gyanta
fenilacetamidometil handle
DCC
néhány lépés
és
vagy
vegyületekbol kiindulva
C-terminális peptidamidok eloállítására más
típusú szilárd hordozó szükséges
MBHA-gyanta (4-metil-benzhidril-amin)
savas hasítás (HF, TFMSA)
4
TFMSA

N-hidroximetil-ftálimid
N2H4
aminometil-gyanta
Gyantakapacitás meghatározása

• Kjeldahl N meghatározás
• pikrinsavas titrálás

• Kjeldahl N meghatározás
• gyanta roncsolása cc. H2SO4-val, 24 óra
• az oldat lúgosítása
• NH3 kidesztillálása, elnyeletés vízben
• titrálás 0,004M H2SO4 oldattal

5
Általánosan alkalmazott oldallánc-védocsoportok a
Boc kémiában
Funkciós csoport
Védocsoport
-OH (Ser, Thr)
Bzl
Meb
Mob
-SH (Cys)
Acm
O
-S-CH3 (Met)
OBzl
-COOH (Asp, Glu)
OcHex
-NH2 (Lys)
Z, ClZ
6
Tos
Mts
BrZ
(Tyr)
For
(Trp)
Tos (t)
(His)
Dnp (t)
p
t
Bom (p)
7
Boc-szintézis protokollja
I. Peptid szekvencia
MW (védett peptid) (szabad peptid)
II. Kiindulási polimer
szubsztitúció (mmol/g) gyanta mennyiség
(g) össz. mmol
Boc
(PAM-gyanta)
III. Lánchosszabbítás DCC/HOBt eljárással dátum
/ /
Aminosav Boc-származék MW
lépés reagens/oldószer ido (perc) ismétlés
A. hasítás 35 TFA/DCM 35 TFA/DCM 2 20
B. mosás DCM 1
C. semlegesítés 10 DIEA/DCM 1
D. mosás DCM 1
E kapcsolás Boc-aminosav (3 ekv, g) minimális térfogat DCM
E kapcsolás DCC/HOBt (3 ekv, g) minimális térfogat DMF 30
F. mosás DMF 1
G. mosás DCM 1
H. ellenorzés ninhidrin negatív pozitív
Negatív teszt folytatás az A lépéstol a
következo aminosav-származékkal Pozitív teszt
újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstol)
8
Kapcsolási módszerek és kapcsoló reagensek
DCC
N-acil-urea
O-acil-izourea

HOBt
R-COOH
H2N-Q
HOBt aktívészter DCU
H2N-Q
H2N-Q
szimmetrikus anhidrid DCU

DCU
BOP
DIPCDI
HOBt
HBTU
BF4-
HOAt
OPfp
TBTU
PyBOP
ODhbt
9
7-aza-1-hidroxibenzotriazol (HOAt)
Apoláros, nehéz szekvenciáknálm sokkal jobb
eredmény, mint HBTU, TBTU, BOP
AOP, HATU, TATU
Z-Gly-Phe-OH H-Pro-NH2
DCC-HOBt kollidin DMF 3,2 LDL
DCC-HOAt " " 1,5
DCC-HOAt " TFE-DCM (13) 2,8
BOP DIEA DMF 4,1
HBTU " " 3,9
HATU " " 1,6
HATU kollidin " 0,8
HAPyU DIEA " 1,3
HAPyU kollidin " 0,6
PyAOP-HOAt " " 0,3
HAPyU-HOAt " " lt0,1
10
In situ semlegesítés
Schnölzer M. et al. Int J Pept Protein Res. 40,
180 (1992)

• Problémák a semlegesítés és a kapcsolás alatt
• C-terminális 1 v. 2 pozícióban Pro ?
  diketopiperazin képzodés,
  dipeptidvesztés a gyantáról
• piroglutaminsav képzodés
• láncletörés HBTU v. TBTU kapcsolódás útján
• acetilezodés (Boc-AA-k EtOAc-ból kristályosítva
  bomlástermékként HOAc-t
  tartalmaz

100 TFA hasítás 2x1 perc DMF mosás folyamatos
v. többször kapcsolás, aktivált Boc-AA, DIEA 10
perc DMF mosás DIC/HOBt esetén 1,5 ekv DIEA a
gyantakapacitásra számolva HBTU esetén pl. 0,2
mmol gyanta, 0,8 mmol Boc-AA-OH 0,76 mmol
HBTU, 1,2 mmol DIEA A problémákat kiküszöbölték
és racemizációt sem tapasztaltak!
11
Boc stratégia végso hasítási protokollja
Tartalmaz-e a peptid His(Dnp) részt?
igen
nem
Dnp eltávolítása tiofenol-DIEA-DMF (334),
6x1óracsak ezután TFA-hasítás
Van-e Boc csoport az N-terminálison?
igen
nem
Boc-csoport hasítása 50 TFA-CH2Cl2, 20 perc
Hasító reagens kiválasztása
HF
TFMSA
TMSOTf
1M TMSOTf-tioanizol/TFA EDT, m-krezol 60-120perc,
C
Low-high TFMSA
Peptid Trp(CHO) részt tartalmez-e?
nem
igen
Standard TFMSA-hasítás TFA-TFMSA-gyökfogó
(80128) 30-120 perc, szobahomérsékleten
Hasítás HF-gyökfogó (pl. 10 anizol) 1 óra,
-5-0C
Trp(CHO) deformilezése piperidin-DMF (11) 1-2
perc, 0C
12
Mellékreakciók az SN1 típusú hasításnál
HF
alkilál Tyr, Trp, Met, Cys
HF
Hasításnál karbokation keletkezik, amelyet
megfelelo gyökfogóval ki lehet iktatni a
rendszerbol.
Asp ? szukcinimid (a-, b-peptid) Glu
? Pyr
aromás amidok acilje
Glu-anizol adduktum
HF
intramolekuláris
intermolekuláris
karbokation elektrofilicitási sorrend
But lt BrZ lt cHex lt 2,6-ClBzl lt Bzl
0,05 0,1 0,5 5,0 20
( 3-alkiltirozin mennyisége)
13
Tioanizol (1M) szerepe a hasításban pull-push
mechanizmus
CF3SO3-

H2O
Védocsoporthasítási reakció TMSOTf-tioanizol/TFA
eleggyel
TMSOTf gyorsabb, mint TFMSA TFMSA
szobahomérséklet, a gyantáról való tökéletesebb
hasításhoz BHA gyantáról nem hasítanak
kielégítoen m-krezol, EDT gyökfogók használata
ajánlott
14
Gyökfogók (scavangers)
Gyenge szerves bázisok gyökfogóként peptidek eros
savas hasításánál
Alkilezodés elleni védelem Alkilezodés elleni védelem Alkilezodés elleni védelem
Gyenge bázis körülbelüli pKa Tyr Trp Met Met(O) redukciója Trp(For) védocsoport hasítása
fenol -8 J K K nem nem
m-krezol -8 J K K nem nem
p-krezol -8 J K K nem nem
anizol -7 K K K nem nem
tiofenol -9,0 K J J nem igen
p-tiokrezol -9,0 K J J nem igen
3,4-ditiotoluol -9,5 K J J nem igen
1,2-ditioetán -8,5 Gy K J nem igen
etántiol -8,5 Gy K K nem igen
tioanizol -8,0 J K Gy igen nem
dimetilszulfid -7,0 K K J igen nem
tetrahidrotifén -6,5 K K J igen nem
1,4-tioxán -6,5 Gy Gy Gy nem nem
difenilszulfid 0 Gy Gy Gy nem nem
metionin -7 K K J igen nem
indol -2 Gy J K nem nem
toluol -13 Gy Gy Gy nem nem
2-tiopiridin -9,5 K K K igen igen
piridin 5 Gy Gy Gy igen igen
J jó, K közepes, Gy gyenge
-minél kisebb negatív érték a pKa, annál kevésbé
protonálja (inaktiválja) a sav a
gyökfogót -azonos típus hatékony (Met,
Trp) -tiofenol típus a legjobb, de nem stabilak
gyökátvivok, más gyökfogóval együtt
alkalmazva -DTT (Cleland-reagens)
1,4-dimerkapto-2,3-butándiol szilárd, nem
büdös, kissé polimerizál -javaslat 10 ml HF 1
g p-krezol 0,1 g DTT
15
Low-High HF hasítás
Tam J.P. et al. Int. J. Pept. Prot. Res., 20, 57
(1383)
Származékok Hasítás mértéke ()
Arg(Mbs), -(Mts), -(Pme), -(Z,Z) 100
Arg(Tos), -(NO2) lt10
Asp(OBzl) 100
Asp(OcHxl) lt10
Cys(MeOBzl) lt80
Cys(Acm), -(MeBzl), -(Bzl) lt2
Glu(OBzl) 100
Glu(OcHxl) lt10
His(Mbs), -(Mts), -(Tos) 100
His(Bom) lt60
His(Dnp) nem teljes (??)
Lys(ClZ), -(Z) 100
Lys(Tfa) lt1
Met(O) 100
Ser(Bzl) 100
Thr(Bzl) 100
Trp(For) 100
Tyr(BrZ), -(Bzl) 100
Tyr(2,6-Cl2Bzl) 85
-OCH2-gyanta, -OCH2-PAM-gyanta lt85
-p-metilbenzhidrilamin-gyanta lt10
-benzhidrilamin-gyanta lt10
-p-aciloxibenzhidrilamin-gyanta lt10

1. 0,2 mmol peptid-gyanta 1 ml p-krezol, 6,5 ml
   DMS ( Trp(For) 0,75 p-krezol 0,25
   p-tiokrezol)
2. 2,5 ml HF
3. 2-3 óra 0C-on hasítás
4. HF, DMS elszívatás (igen hosszadalmas lehet)
5. 10 ml HF (friss scavanger)
6. 45 perc 0c-on hasítás
7. HF elpárologtatás

HF-DMS-p-krezol (256510 v/v), 0C, 3 óra
low HF Met(O) ? Met Trp(For) ? Trp nem
képzodik közben karbokation
low HF SN2 típusú reakció high HF SN1 típusú
reakció
low TFMSA 15 TFMSA, 30 DMS, 55 TFA
16
Fmoc/t-butil stratégia
hasítás bázissal (piperidin/DMF)
TFA-ra hasad
Szerves szekunder aminok Piperidin, morfolin,
dietilamin DBU, TBAF
A para-alkoxi szubsztituens csökkenti a
peptid-gyanta kötés savval szembeni stabilitását
A piperidinnel kiváltott Fmoc hasítás mechanizmusa
CO2
piperidin
dibenzofulvén-piperidin addukt eros
UV-elnyelést mutat 304 nm-nél, ami alkalmas a
detektálásra
Számos lehetoséget dolgoztak ki a peptid-gyanta
közötti kapcsolat kialakítására, amelyek
segítségével szabad karboxil vagy amid
C-terminálisú peptidekhez, illetve védett
peptidfragmensekhez juthatunk
17
Szerkezet Hasítás Keletkezo
C-terminális
TFA COOH
p-alkoxi-benzil (Wang) gyanta
TFA COOH
3-(4-hidroximetil-fenoxi)propionsav
handle Albericio Barany, IJJPR, 23, 342 (1984)
TFA CONH2
4-(4-metoxi-benzhidril)fenoxi-ecetsav
handle Breipohl et al., TL 28, 5651 (1987)
TFA CONH2
5-(4-aminometil-3,5-dimetoxi-fenoxi)-valeriánsav
handle Albericio Barany, IJJPR 30, 206 (1987)
1 TFA CH2Cl2 COOH
4-(4-hidroximetil-3-metoxi-fenoxi)-butánsav
handle Flörsheimer Riniker, Peptides 1990, 131
(1990)
18
Szerkezet Hasítás Keletkezo
C-terminális
Pd0 COOH
hidroxikrotonil-aminometil gyanta (HYCRAM
gyanta) Kunz et al., Peptides 1988, pp. 154-156
AcOH COOH
2-klór-tritil gyanta Barlos et al., TL, 30, 3947
(1989)
AcOH, híg TFA CONH2
4-(2,4-dimetoxi-fenil-aminometil)-fenoxi
gyanta Rink, TL, 28, 3787 (1987)
AcOH, híg TFA CONH2
4-(2,4-dimetoxi-fenil-aminometil)-fenol
handle Rink, TL, 28, 3787 (1987)
19
Általánosan alkalmazott oldallánc-védocsoportok
az Fmoc kémiában
Funkciós csoport
Védocsoport
-OH (Ser, Thr)
tBu
-SH (Cys)
(Tyr)
OtBu
-COOH (Asp, Glu)
-NH2 (Lys)
Boc
-SH (Cys)
Trt
20
Mtr
Pmc
(Arg)
Adoc2
Boc (t)
Bom (p)
p
t
(His)
Trt (t)
21
Fmoc-szintézis protokollja
I. Peptid szekvencia
MW (védett peptid) (szabad peptid)
II. Kiindulási polimer
szubsztitúció (mmol/g) gyanta mennyiség
(g) össz. mmol
Fmoc
-OCH2-F- OCH2-F-R
(Wang-gyanta)
III. Lánchosszabbítás DIC/HOBt eljárással dátum
/ /
Aminosav Fmoc-származék MW
lépés reagens/oldószer ido (perc) ismétlés
A. hasítás 20 piperidin/DMF 20 piperidin/DMF 1 20
B. mosás DMF 1
C. kapcsolás Fmoc-aminosav (3 ekv, g) minimális térfogat DMF
C. kapcsolás DIC/HOBt (3 ekv, g) minimális térfogat DMF 30
D. mosás DMF 1
E. ellenorzés ninhidrin negatív pozitív
Negatív teszt folytatás az A lépéstol a
következo aminosav-származékkal Pozitív teszt
újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstol)
22
Fmoc stratégia végso hasítási protokollja
Tartalmaz-e a peptid Fmoc csoportot az
N-terminálison?
igen
nem
Fmoc csoport hasítása 20 piperidin/DMF 30
perc szobahomérséklet
Tartalmaz-e a peptid Arg, Met, Trp aminosavakat
vagy Trt védocsoportot?
nem
igen
Arg, Met tartalom a peptidben
Hasítóelegy A 95 TFA, 5 gyökfogó
nem
nem
igen
Trp vagy Trt védocsoportot tartalmaz-e a peptid?
Hasítóelegy B 10 ml TFA 0,25 ml EDT 0,5 ml
tioanizol 0,5 ml H2O 0,75 g fenol
igen
Hasítóelegy C 95 TFA, 2,5 EDT, 2,5 H2O
H2O, anizol, stb.
23
Ciklopeptidek kialakítása gyantán
OcHex
Bzl
MBHA
Bzl
OcHex
Boc-SALLEDPVG-
Boc-SALLEDPVG-
MBHA
OFm
OBzl
0,2M TBAF/DMF (20 perc)

1. 33 TFA/DCM (220 perc)
2. 1M TMSOTf-tioanizol/TFA(30 perc, 0C)
3. 10 DIEA/DCM (3x1 perc)

Bzl
OcHex
MBHA
Boc-SALLEDPVG-

1. 40 TFA/DCM (120 perc)
2. 5 DIEA/DCM (3x1 perc)

OcHex
Bzl
OcHex
H-SALLEDPVG-
BHA
H-SALLEDPVG-
MBHA
BOP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/DMF
BOP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/DMF 1 éjszaka
OcHex
Bzl
OcHex
MBHA
SALLEDPVG-
BHA
SALLEDPVG-
HF-anizol (91) (1 óra, 0C)
HF-p-krezol-DTT (1010,1) (1 óra, 0C)
SALLEDPVG-NH2
SALLEDPVG-NH2
24
Diszulfidhíd kialakítása polimer hordozón
SAcm
SAcm
SMeb
SMeb
1
1
2
7
R
Fmoc
7
10
PAL
R
Boc
PAM
3
13
13
18
21
STmob
STmob
SFm
SFm
piperidin-DMF (11) 25C, 3 óra

1. Fmoc hasítás
2. TFA-DCM-Et3SiH-H2O(7920,50,5)

SMeb
SMeb
SAcm
SAcm
Boc
R
PAM
R
H
PAL
S
S
SH
SH
HFp-krezol (91) 0C, 1 óra
0,02M CCl4-Et3N/NMP 20C, 4 óra
SAcm
SAcm
SH
SH
R
H
H
OH
PAL
S
S
S
S
levego oxidáció pH8,0 25C, 36 óra
Tl(tfa)3 (2ekv)/DMF-anizol (191) 4C, 18 óra
S
S
S
S
R
H
PAL
H
OH
S
S
S
S
TFA-DCM-Et3SiH-H2O(9540,50,5) 25C, 2 óra
PAL trisz(alkoxi)benzilamid linker
5-(4-Fmoc-)aminometil-3,5-
dimetoxi-fenoxi-valeriánsav Tmob
2,4,6-trimetoxi-benzil Tl(tfa)3
tallium(III)-trifluor-acetát NMP
N-metil-pirrolidon
S
S
H
NH2
S
S