Aspetti generali

1
Aspetti generali della Trasduzione del Segnale
Concetti chiave Specificità Amplificazione Integr
azione Interruttori On-Off Feedback
2
Gli organismi multicellulari e in particolare i
neuroni hanno GROSSI problemi di comunicazione
Hei tu I tuoi outputs sono troppo deboli!!!
Oi! Abbiamo bisogno di inputs!
Per piacere, vuoi smettere di inviare segnali?
Avanti N. 7, adesso devi spegnerti!
3
I Problemi del Signalling
Le cellule in generale, e i neuroni in
particolare, sono esposti a una moltitudine di
segnali inclusi quelli provenienti da altre
cellule (p.es. segnali derivati da lipidi,
piccole molecole organiche o peptidi) così come
stimoli ambientali (p.es. luce, calore o
variazioni dellosmolarità)
Selezionare i segnali rilevanti da quelli
irrilevanti
Captare segnali di bassa intensità
Tradurre segnali diversi in un comune
linguaggio intracellulare
4
Le soluzioni
Selezionare i segnali rilevanti da quelli
irrilevanti
Recettori con un alto grado di specificità
Captare segnali di bassa intensità (ad es. a
basse concentrazioni)
Recettori ad alta affinità accoppiati ad un
sistema di amplificazione
Tradurre segnali diversi in un comune
linguaggio intracellulare
Attivazione di vie di signalling disegnate
attorno a un limitato numero di processi comuni
5
Cosa fanno I segnali
Le cellule rispondono ai segnali in una varietà
di modi
Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione
del metabolismo del glicogeno in risposta
allinsulina
Eccitamento p.es. propagazione dellimpulso
nervoso in risposta a neurotrasmettitori
Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a
fattori di crescita
Morte cellulare programmata causata da specifici
fattori di morte o dalla rimozione di alcuni
fattori essenziali
Espressione genica alterata p.es. Sintesi di
nuove proteine di membrana in risposta ad un
incremento dellattività sinaptica (plasticità
sinaptica)
6
Far attraversare il segnale
Dominio di legame extracellulare
Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non
possono attraversare la membrana ploasmatica. Le
cellule risolvono questo problema utilizzando
recettori transmembrana. Questi sono proteine
posizionate in membrana con il sito attivo per il
ligando sul lato extracellulare e un dominio
intracellulare che si accoppia al passo
successivo nella catena di trasduzione del
segnale Ligando una molecola che si lega ed è
riconosciuta da un recettore
Membrana plasmatica
esterno
iinterno
Dominio transmembrana
Dominio intracellulare si accoppia al passo
successivo (può avere attività enzimatica)
7
Definizione di Recettore
Affinchè una proteina possa essere classificata
come recettore (e non una semplice proteina di
legame) devono essere soddisfatti diversi criteri
Specificità un recettore deve essere in grado
di distinguere tra segnali spesso strettamente
correlati
Alta affinità Le molecole segnalatrici sono
spesso presenti a basse concentrazioni I
recettori possono spesso captare concentrazioni
tra nM e pM
Saturabilità una cellula ha un numero finito di
recettori, quindi vi è un limite al numero di
molecole di ligando che una cellula può legare
Reversibilità lassociazione ligando-recettore
non è covalente quando la concentrazione del
ligando diminuisce il complesso può dissociarsi
Accoppiamento il recettore trasferisce un
segnale dal ligando alla cellula
É questultima caratteristica, più di ogni altra
che contraddistingue un recettore da una proteina
di legame
8
Curva di attivazione - Saturazione
k1
k2
k3
(A) Se varia il numero dei recettori presenti si
modifica il livello di saturazione della
curva (B) Se varia laffinità del recettore per
il messaggero la curva trasla sullasse delle
concentrazioni senza che si modifichi il livello
di saturazione.
9
Risposte iperboliche e sigmoidi
Una risposta sigmoide denota cooperatività e
insorge ogni qual volta un recettore (o un
enzima) presenta n siti di binding per il
ligando s (ncoefficiente di Hill è un numero
intero gt1)
Una risposta iperbolica insorge ogni qual volta
un recettore (o un enzima) presenta un unico sito
di binding per il ligando s
Risposta sigmoide
Risposta iperbolica
Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di
molte cascate di signaling, e rappresentano ciò
che i biologi chiamano una risposta
ultrasensibile ad un input.
10
Una doppia fosforilazione come causa di
ultrasensibiltà
Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs
da molecole di signaling presenti in membrana in
risposta a stimoli extracellulari.
Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?
11
Un importante aspetto del comportamento allo
stato stazionario di un sistema di signaling è la
forma della curva stimolo-risposta del sistema.
Un esempio molto comune di sistemi che mostrano
curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato
dagli enzimi cooperativi.
Un enzima che mostra sensibilità iperbolica
richiede un incremento dello stimolo di input di
81 volte per essere portato dal 10 al 90 di
attivazione massima. Al contrario, alcuni enzimi
e sistemi di signaling mostrano curve
stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben
approssimate dallequazione di Hill y
xnH/(EC50 xnH)
Un sistema ultrasensibile richiede un incremento
inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per
guidarlo dal 10 al 90 di massima attivazione
12
La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta
marcatamente ultrasensibile
Attività di Erk2 allo stato-stazionario
Erk2MAPK MosMAPKKK
Mos (nM)
La risposta è marcatamente ripida mentre un
enzima con risposta iperbolica richiede un
incremento di 81 volte dello stimolo di input per
guidarlo dal 10 al 90 di attivazione massima,
Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5
volte
Pertanto, cè qualcosa nel meccanismo a cascata
che genera una risposta ad interruttore partendo
da stimoli graduali.
13
La doppia fosforilazione avviene mediante una
doppia collisione

• La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK
• La seconda fosforilazione richiede una seconda
  collisione
• ?
• allora la velocità di conversione della MAPKK
  fosforilata a doppiamente fosforilata aumenterà
  con il quadrato della concentrazione dello
  stimolo
• La reazione del secondo ordine si traduce in una
  curva stimolo-risposta ultrasensibile con un
  coefficiente di Hill di 2.
• Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata
  mediante un meccanismo a doppia collisione.

14
Schema di una cascata di MAPK
Lattivazione delle MAPK dipende dalla
fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la
completa attivazione di MAPKK richiede la
fosforilazione di due siti. Qui si assume che le
MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi
denominati El e E2. MAPKKK rappresenta la MAPKKK
attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK
singolarmente e doppiamente fosforilate,
rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano
MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate,
rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.
15
Cinetiche di ordine 1 e zero
Vero ordine zero per vVmax
Vero primo ordine

• v in funzione di S, per un ampio range di S
• v in funzione di S, per un ridotto range di S
  dove S ltlt Km (cinetica del 1 ordine)
• v in funzione di S, per un range di S dove
  S gt Km (cinetica di ordine zero)
• Per semplicità si è plottato S, dove
  SS/Km

16
Derivazione grafica delle curve
stimolo-risposta Sensibilità iperbolica
Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilaz
ione un substrato S è fosforilato da una kinasi
per ottenere S-P, che può essere defosforilato da
una fosfatasi per riottenere S.
Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano
lontani dalla saturazione.
3.5
3
Allora la velocità della reazione verso destra
(linea continua) diminuirà e quella verso
sinistra (linea tratteggiata) aumenterà, entrambe
linearmente (reazione del primo ordine)
allaumentare della percentuale di substrato
fosforilato
2.5
3
2
Velocità di reazione
2
1.5
kinasi
1
1
0.5
0
0
20
40
60
80
100
S-P come di S S-P totale
Nel punto di intersezione delle linee
tratteggiata e continua il sistema è allo stato
stazionario.
17
Derivazione grafica delle curve
stimolo-risposta Sensibilità iperbolica
Raddoppiando la concentrazione della kinasi la
pendenza della linea della reazione verso destra
raddoppia. Adesso la velocità della reazione
verso destra sarà superiore a quella della
reazione inversa, e il livello di S-P aumenterà.
Però, aumentando S-P la velocità della reazione
verso destra decadrà e la velocità della reazione
inverse aumenterà. Verrà eventualmente raggiunto
un nuovo stato stazionario, con il punto di
intersezione e la percentuale di S-P allo stato
stazionario spostati a destra.
18
Derivazione grafica delle curve
stimolo-risposta Sensibilità iperbolica
Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario
del precedente grafico in funzione della kinasi
si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica
Il sistema è massimamente sensibile (la curva
stimolo-risposta ha la massima pendenza) a bassi
livelli di stimolo, e diventa progressivamente
meno sensibile allaumentare dello stimolo.
19
Derivazione grafica delle curve
stimolo-risposta Ultrasensibilità a steps multipli
La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea
continua), con nH2. La curva sigmoide ha
maggiore pendenza di quella iperbolica (linea
tratteggiata) per stimoli intorno alla EC50, ma è
meno ripida per stimoli molto piccoli e molto
grandi.
20
Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero
Lultrasensibilità può anche insorgere quando la
kinasi e la fosfatasi operano vicino alla
saturazione. In effetti le MAPK sono
fisiologicamente presenti a concentrazioni
sufficientemente elevate da saturare parzialmente
le MAPKK.
Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente
saturati, le loro velocità non variano
linearmente allaumentare di S-P le rette sono
sostituite con curve iperboliche.
La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea
continua), con nH2.5. La curva iperbolica è
rappresentata dalla linea tratteggiata.
21
Interruttori di accensione e spegnimento
La maggior parte dei segnali è transitoria e pure
la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si
accende un segnale, cè anche bisogno di una via
per spegnerlo. Per esempio, il mancato
spegnimento di un segnale che fa aumentare la
Ca2 nel citosol è una delle cause che induce
la morte cellulare. Pertanto, ciò che andiamo
cercando sono dei sistemi biochimici in grado di
passare rapidamente tra due stati acceso (on) e
spento (off). In molti sistemi di signalling
accensione e spegnimento sono operati da proteine
G e/o da proteine di fosforilazione
22
Interruttori On-Off Proteine G eterotrimeriche
Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele
proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello
delle proteine G monomeriche.
g
Scambio del GDP legato col GTP
b
GTP
a
INATTIVA
GDP
GDP
a
La subunità a si dissocia da bg
GTP
ATTIVA
Pi
La subunità a attiva può interagire con lo step
successivo della catena di ì signalling e
attivarlo
a
Attività GTPasica della subunità a GTP ? GDPPi
GDP
La subunità a si riassocia a bg
23
Interruttori On-Off Proteine G monomeriche
Ras (p21ras) è un buon esempio per questo tipo di
switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina
monomerica che lega il GTP o il GDP e ha
unattività GTPasica intrinseca
Il fattore di scambio del nucleotide guanidinico
(GEF) interagisce con ras
Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP
p21ras
ras attivata interagisce con il componente
successivo della catena di signalling e lo attiva
On
GTP
GDP
ATTIVA
INATTIVA
Pi
Ras GTPasi stimolata dallassociazione con la
GTPase-activating protein (GAP)
Off
Lattività GTPasica intrinseca idrolizza il GTP a
GDP e Pi
24

• Attivatori di ras
• G-protein Exchange Factors (GEF)
• SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella
  regolazione della via della crescita cellulare
  MAPK/ERK.
• eIF-2b (Eukaryotic Initiation Factor 2) è
  richiesto per dare inizio alla sintesi proteica.
• Ras-GRF1.
• Recettori per fattori di crescita.

25
Interruttori On-Off Proteine di
fosforilazione/defosforilazione
Protein Kinasi trasferiscono un fosfato
dallATP ad amino acidi specifici
Protein Fosfatasi rimuovono un fosfato da
specifici amino acidi
O-fosfoserina
Kinasi
Fosfatasi
ATP
ADP
Pi
Fosforilazione
Defosforilazione
O-fosfoserina
26
Interruttori On-Off Proteine di fosforilazione
Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano
specifici amino acidi
Amino Acido Kinasi Fosfatasi
Ser Thr Protein kinasi C MAP kinasi PP1 PP2A
Tyr Recettore per lEGF pp60c-src CD45
Thr Tyr (Doppia specificità) MAP kinasi kinasi AtDsPTP1
27
Meccanismi di Trasferimento dellInformazione

• Un cambiamento nello stato di attività di un
  componente a monte porta ad un cambiamento
  dellattività di un componente a valle.
• Il cambiamento può essere attivante o inibente.
  Esso è interazione-specifico. (p.es. La
  fosforilazione del target può aumentarne o
  diminuirne lattività)

28
Secondi Messaggeri
Tipicamente composti a basso peso molecolare
prodotti allinterno della cellula da un enzima
stimolato dal legame di un ligando a un recettore
Adenilato Ciclasi
Fosfolipasi C b
In entrambi questi sistemi il legame di un
singolo ligando ad un recettore produrrà un gran
numero di molecole di secondo messaggero -
AMPLIFICAZIONE - un ruolo chiave per i secondi
messaggeri
Membrana plasmatica
PIP2
DAG
a
PLC
GTP
Attiva la Protein Kinasi C
Attivata dalla subunità a di Gs
Induce un aumento del Ca2 citosolico
IP3
Attivata da recettori legati a Gq
ATP
AMP ciclico
2Pi
PIP2 fosfatidilinositolo difosfato IP3
inositolo trifosfato DAG - diacilglicerolo
Attiva la Protein Kinasi A
29
Amplificazione
30
Calcio il messaggero universale
Il Ca2 è mantenuto ad una concentrazione
estremamente bassa nel citosol (a causa della sua
tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca2 è
alta fuori dalla cellula e allinterno di alcuni
organelli Lapertura rapida e transitoria di
canali permette al Ca2 di fluire nel citosol
seguendo il suo gradiente di concentrazione e
costituisce la base di un sistema di signalling
ubiquitario
31
Calcio il messaggero universale
Lattivazione della PLC porta alla formazione di
IP3 solubile in acqua
DAG
PLC
PKC
La Calmodulina può attivare pompe del Ca2 sulla
membrana plasmatica abbassando la Ca2
citosolico
LIP3 si lega al recettore per lIP3 sul reticolo
endoplasmatico e apre un canale del Ca2 (che fa
parte del recettore)
Il Ca2 rilasciato dal RE si lega alle
Calmoduline permettendole di interagire con altre
proteine e attivarle
La Calmodulina può attivare pompe del Ca2 del
reticolo endoplasmatico abbassando la Ca2
citosolico
La Calmodulina attiva una vasta gamma di
proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti
32
Vie o Networks

• Generalmente le vie coinvolgono una serie di
  reazioni a cascata che portano ad un flusso
  lineare dellinformazione
• Esempi di vie
• 1) Vie delle Proteine G
• 2) Via di RasMAPK
• I networks (reti) sorgono da interazioni in cui
  un componente di una via regola lattività di una
  seconda via

33
La via Gq-PLC-b
34
Chinasi a cascata
Lattivazione di ras da parte della CaMKII attiva
la via delle MAP chinasi
ras
raf
ras
GTP
Cascata delle MAP chinasi
Il Ca2 si lega alle calmoduline
Risposta
La Calmodulina attiva una vasta gamma di
proteine, p.es la kinasi II calmodulina-dipendenti
35
Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk
A volte, molecole non direttamente coinvolte in
una reazione enzimatica possono interagire
allostericamente con lenzima stesso alterando la
conformazione dellenzima e quindi la sua
velocità di reazione. Quando sono gli stessi
substrato o prodotto dellenzima ad interagire
allostericamente con esso, essi possono mediare
interazioni a feedback o a feedforward con la via
metabolica in cui è coinvolto lenzima, oppure
mediare un cross-talk tra vie metaboliche
parallele.
36
Meccanismi a feedback
In una interazione a feedback, il prodotto di una
reazione enzimatica influenza lattività di un
altro enzima che lo precede nella via metabolica.
(A) Feedback negativo in un semplice schema di
reazione lineare. Il metabolita X è trasformato
in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z
inibisce lenzima E1 che catalizza la reazione
X?Y.
(B) Feedback positivo in un semplice schema di
reazione lineare. Il metabolita X è trasformato
in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z
stimolsa lenzima E1 che catalizza la reazione
X?Y.
37
Meccanismi a feedforward
In una interazione a feedforward, il prodotto di
una reazione enzimatica influenza lattività di
un altro enzima che lo segue nella via metabolica.
Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il
metabolita X è trasformato in Y, a sua volta
trasformato nel prodotto Z. X stimola lenzima E2
che catalizza la reazione Y?Z.
38
Reti di signaling e comunicazione incrociata
(cross-talk)
Nel cross-talk il metabolita di una via influenza
lattività dellenzima di unaltra via.
Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste
in sei recettori e tre protein kinasi
citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce
verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2
o entrambe con un meccanismo non specificato.
Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la
kinasi di output), questa rete si attiverà
massimalmente solo quando saranno presenti
combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.
39
Segnali multipli Crosstalk di recettori
Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il
segnale A inibisce la proliferazione, mentre il
segnale B stimola la proliferazione
A
B
chinasi
che fosforila e inattiva il recettore per il
segnale B - risultato nessuna proliferazione
Il segnale A attiva una chinasi
Se il crosstalk lavora solo in una direzione
(ad es. da A a B) allora il segnale A sarà
dominante Se il crosstalk lavora in entrambe le
direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi
fattori p.es. Timing della percezione del
segnale Densità relativa dei recettori Ampiezza
relativa del segnale
40
Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può
influenzare cambiamenti sinaptici indotti da
stimoli
41
In particolare, la capacità della PKC di regolare
la MAPK e della MAPK di regolare la PKC porta ad
una interazione tra le due vie (feedback pos.)
B (basale) stabile T (soglia) metastabile A
(attivo) stabile

• Il punto A rappresenta uno stato di attività alta
  sia per la PKC che per la MAPK, mentre il punto B
  rappresenta uno stato di bassa attività.
• Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di
  stati stazionari. Un sistema dI questo tipo è
  definito bistabile.
• Il punto di biforcazione T è importante perché
  definisce la soglia di biforcazione.
• Con A viene innescato un loop a feedback positivo
  che diventa indipendente dallattivazione del
  recettore.

42
Feedback negativo ed oscillazioni

• Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC)
  sono regolate dalla via della PLC.
• LAC è intimamente associata a siti di ingresso
  del Ca2 nella cellula.
• Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare
  insorgono a causa di una inibizione a feedback
  dellAC Ca2-dipendente.
• Quindi il signalling dellAMPc si interseca con
  il Ca2 intracellulare ed estende le sue modalità
  di regolazione.

43
Feedback negativo ed oscillazioni
Il modello mette in relazione i livelli di AMPc e
lingresso di Ca2. LAMPc attiva canali del Ca2
(Y). Lingresso di Ca2 aumenta. Il Ca2
intracellulare inibisce ladenilato ciclasi (AC).
Leffetto complessivo è un loop a feedback
negativo in cui lAMPc inibisce la sua stessa
produzione. Oscillazioni nellAMPc e nel Ca2
sono sostenute dal loop a feedback negativo.
44
Feedback positivo

• Problema come può essere immagazzinata
  informazione, ad es. nel sistema nervoso,
  partendo da molecole instabili?
• Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione
  come un meccanismo di
• immagazzinamento di informazione.
• La fosforilazione è un meccanismo comune per
  attivare/disattivare enzimi.
• Supponiamo che un bit di informazione sia stato
  immagazzinato in un neurone in seguito alla
  fosforilazione di un enzima chiave attivandolo.
• In assenza di una fosfatasi defosforilante lo
  stato acceso (on) dellenzima potrebbe durare a
  lungo.

45
In assenza di una fosfatasi defosforilante lo
stato acceso (on) dellenzima potrebbe durare a
lungo. Difficoltà In realtà, lemivita della
proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo
stato on dellenzima. Quesito centrale È
possibile costruire interruttori molecolari
stabili? Secondo questo articolo è possibile
costruire interruttori molecolari in grado di
immagazzinare informazione indefinitamente,
utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in
maniera estremamente semplice.
46
Interruttori molecolari bistabili

• Reazioni in un interruttore bistabile.
• Linterruttore è costituito da due proteine la
  kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo
  (K1) o in uno stato attivo (K1p), e una
  fosfatasi.
• La transizione tra gli stati inattivo e attivo è
  dovuta a una reazione di fosforilazione.
• La fosforilazione può essere catalizzata dalla
  kinasi-1 attiva (feedback positivo)
• o dalla kinasi-2 attivata durante una
  stimolazione neuronale.

47
In assenza di attività della Kinasi-2,
linterruttore è descritto da quattro equazioni
Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della
concentrazione della Kinasi-1 attiva dK1p/dt, è
la differenza tra le velocità di reazione della
kinasi e della fosfatasi. Eq. 2 è la legge di
conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma
della kinasi-1 attiva e inattiva. Eq. 3
descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di
cinetiche di Michaelis-Menten, dove Km1 e Km2
sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e
la fosfatasi, rispettivamente C1 e C2 sono i
numeri di turnover della kinasi-1 e della
fosfatasi, rispettivamente, e P è la
concentrazione della fosfatasi. Eq. 4 è
ottenuta sostituendo leq.2 nella 3.
48

• In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità
  di reazione della fosfatasi è zero.
• Allaumentare di K1p, la velocità di reazione
  della fosfatasi aumenta fino alla saturazione.
• La velocità della reazione della kinasi-1 aumenta
  allaumentare di K1p, ma la velocità decresce
  nuovamente per concentrazioni elevate di K1p
  perchè vi è poca proteina non fosforilata da
  fosforilare.

49
Grafico della derivata di K1p (Eq. 4) rispetto
al tempo in funzione di K1p/T. La derivata
prima rispetto al tempo della concentrazione di
kinasi-1 attiva (dKpl/dt) è la differenza tra le
velocità delle reazioni della kinasi e della
fosfatasi. Allo stato stazionario (equilibrio)
sara

• I punti in corrispondenza di K1p/T 0 e di K1p
  /T ? 0.74 rappresentano gli stati stabili.
• Ad esempio
• se K1p /T gt 0 ma lt 0.22, dK1p/dt è negativa e
  K1p ritornerà velocemente a zero
• se K1p/T gt 0.22 ma lt 0.74, dK1p/dt è positiva e
  K1p/T aumenterà a 0.74,
• se K1p/T diventa gt 0.74, dK1p/dt è negativa e
  K1p/T scenderà verso 0.74.

Affinchè uno stato sia stabile, deve essere
dK1p/dt 0 e d2K1p/dt2 deve essere negativa.
Questa seconda condizione è richiesta affinchè
una piccola deviazione da uno stato stabile sia
seguita da un ritorno spontaneo a quello
stato. In questo esempio i criteri di stabilità
sono incontrati in due punti K1p/T 0 e K1p/T
? 0.74, mentre K1p/T ? 0.22 rappresenta uno
stato instabile.
Stati stabili
stato instabile K1p/T?0.22
50
Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve
essere dK1p/dt 0 e d2K1p/dt2 lt0
0.22
0.74
In questo esempio i criteri di stabilità sono
incontrati nei due punti K1p/T 0 e K1p/T ?
0.74, mentre K1p/T ? 0.22 rappresenta un punto
di equilibrio instabile
51
stato stabile (fosforil.)
stato instabile
stato stabile (defosforil.)
Le curve convergono verso i due punti stabili
K1p/T 0 e K1p/T 0.74 a seconda che la
concentrazione iniziale (normalizzata) di K1p
sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22,
che rappresenta il punto di equilibrio instabile.
52
Linterruttore può essere acceso permanentemente
da uno stimolo esterno
Effetto della stimolazione sullinterruttore Stimo
li di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in
modo graduale.
Lattivazione risultante della kinasi-1 è
anchessa graduale finchè la sua attivazione
diviene rigenerativa. Da quel momento, lattività
della kinasi-1 rimane alta anche quando lo
stimolo verrà rimosso.
53
Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo
termine
54
La densità postsinaptica o postsynaptic
density (PSD) è una zona specializzata densa di
proteine attaccate al lato citosolico della
membrana postsinaptica.

• La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie
  del SNC, consiste di recettori ionotropici,
  proteine di sostegno e del citoscheletro, e
  molecole di signaling.
• Tali proteine creano un microdominio di
  signaling, che traduce inputs presinaptici in
  risposte postsinaptiche.
• Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA
  ed NMDA, mediano la la trasmissione eccitatoria
  rapida.

55
Trasmissione Sinaptica
Glutamato
Potenziale dazione
NMDAR
NMDAR
Mg
AMPAR
AMPAR
Mg
Na
Na
Ca
I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione
della membrana postsinaptica, che a sua volta
aiuta lapertura dei recettori NMDA a generare
lingresso di Ca2 che innesca cascate di
signaling.
56
Long-term potentiation (LTP) un aumento della
forza sinaptica
Il potenziamento a lungo termine o LTP è una
forma sinapsi-specifica di plasticità che
potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di
memoria.
Protocollo di LTP che induce un ingresso
postsinaptico di Ca2
Corrente postsimnaptica
Tempo (min)
60
0
Bliss Lomo J Physiol, 1973
57
Long-term potentiation (LTP) un aumento della
forza sinaptica
Protocollo di LTP che induce un ingresso
postsinaptico di Ca2
con un inibitore della CaMKII non cè LTP
Corrente postsimnaptica
Tempo (min)
60
0
Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998
58
CaMKII a bassa attività Potenziamento precoce
(memoria a breve termine?) Le CaMKII attivate
agiscono su proteine preesistenti in attesa di
essere attivate. Ad es., fosforilazione di
recettori AMPA ? risposta postsinaptica più
intensa a parità di glutammato liberato
fosforilazione
AMPAR
CaMKII
CaMKII
LTP
Ca
NMDAR
CaMKII ad alta attività Potenziamento tardivo
(memoria a lungo termine?)
59
Premessa La CaMKII è localizzata nella PSD ed è
richiesta per linduzione di LTP

• La protein kinasi II Ca2/calmodulina-dipendene
  (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione
  ideale per giocare un ruolo chiave nellLTP,
  essendo virtualmente in grado di indurre i
  processi a valle che potenziano la trasmissione
  sinaptica.
• Lingresso transiente di Ca2 attraverso canali
  NMDA, che avviene durante linduzione dellLTP,
  stimola lautofosforilazione persistente e
  lattivazione della CaMKII.
• Lattivazione persistente della CaMKII suggerisce
  che essa possa agire come un interruttore
  bistabile responsabile del rafforzamento
  tutto-o-nulla delle singole sinapsi.

Obiettivo Comprendere il meccanismo di accensione
della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII
possa rimanere in uno stato altamente fosforilato
nonostante lattività delle fosfatasi endogene.
60
Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente
La CaMKII è una proteina multimerica in cui
loloenzima è costituito da 8 a 12 subunità,
ciascuna delle quali ha unattività
kinasica. Ciascuna subunità è fosforilabile e il
sito di fosforilazione è rappresentato dalla
Thr286. La defosforilazione della CaMKII avviene
per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD
da proteine strutturali.
Un oloenzima 8/12 subunità
Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito
catalitico. La Ca2/calmodulina rimuove il
dominio autoinibitorio dal sito catalitico
causando fosforilazione e attivazione.
Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad
anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si
assemblano in due anelli coplanari, ciascuno
contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad
anello si realizza lautofosforilazione mediante
un processo in cui una subunità fosforila quella
accanto.
61
Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1
nel PSD
La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato
attivato (on) nel quale la maggior parte delle
8/12 subunità sono fosforilate a livello della
Thr286 e in uno stato disattivato (off) nel
quale esse sono quasi completamente defosforilate.
Stato on
Stato off
Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella
PSD ad operare come un interruttore che presenta
due diversi stati stabili a concentrazioni basali
di Ca2 intracellulare? Loperazione di
attivazione è basata su tre reazioni che possono
avvenire ai livelli basali di Ca2.
62

1. Se nessun sito Thr286 in un anello è
   fosforilato, la prima autofosforilazione richiede
   il legame di due molecole di Ca2/calmodulina
   una per attivare la subunità catalitica della
   CaMKII, e laltra per esporre la Thr286 della
   subunità adiacente che funge da substrato.

C complesso Ca2-calmodulina Pooloenzima non
fosforilato P1oloenz. fosforil. una volta
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per
sito, v1. dipenderà dalla seconda potenza della
Ca2/calmodulina, che a sua volta dipende dalla
quarta potenza della Ca2
(1)
v1 velocità di inizio dellautofosforilazione
per sito (subunità) k1 costante di velocità
dello step di autofosforilazione elementare KH1
Ca250 per lattivazione della CaMKII (0.7 µM,
Kuret and Schulman, 1984) Ca2i a riposo (100
nM) ltlt KH1 ? linizio procederà lentamente alla
Ca2 di riposo.
63
Pertanto, la velocità di autofosforilazione per
sito, v2, della CaMKII parzialmente fosforilata
sarà superiore a v1, in quanto dipenderà solo
dalla quarta potenza della Ca2
(2)
64
(3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono
defosforilati ad opera esclusivamente della PP1
tenuta nel PSD da proteine di sostegno il
contributo delle altre fosfatasi è minimo in
quanto non sono in grado di funzionare nella PSD.
La defosforilazione delle subunità procede
secondo lo schema di Michaelis-Menten SP
subunità fosforilata S subunità
defosforilata E fosfatasi
Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è
il volume della PSD allinterno del quale la
concentrazione delle subunità della CaMKII è
100200 µM. Se vi è un numero significativamente
elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la
loro concentrazione sarà molto più alta della KM
della fosfatasi (1 µM), e vi sarà saturazione
della fosfatasi.
65

• Interpretazione intuitiva di come questo sistema
  chimico può operare da interruttore
• Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo
  fosforilati, la velocità alla quale i siti
  disponibili diventano autofosforilati è bassa
  perchè la reazione (1) è lenta.
• Al contrario, la PP1 può rapidamente
  defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa
  non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la
  PP1 deve intervenire).
• Lo stato off è pertanto stabile poichè la
  velocità di autofosforilazione della CaMKII per
  sito è bassa rispetto alla velocità della
  fosfatasi per sito.
• Questa situazione è ribaltata nello stato on.
• In questo caso, la reazione della CaMKII è più
  veloce (essendo richiesta solo una calmodulina
  per la reazione (2).
• Daltro canto, lalta concentrazione di subunità
  fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità
  alla quale essa può defosforilare le varie
  subunità è pertanto bassa.
• Lo stato on è quindi stabile essendo la
  velocità di autofosforilazione della CaMKII per
  sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi
  per sito.

66
La simulazione mette in evidenza lesistenza di
un sistema bistabile a Ca2in basali che
dipende dalle proprietà della fosfatasi presente
nel PSD
Allo stato stazionario, il livello di
fosforilazione delle Thr286 varia con la
concentrazione intracellulare di Ca2.
Vi sono due livelli stabili (punti neri) di
fosforilazione a Ca2in basali (linea
verticale). Il sistema è bistabile in un ampio
intervallo di Ca2in (area ombreggiata). Il
punto rosso indica la percentuale totale di siti
di Thr286 fosforilati dopo che il 20
delloloenzima della CaMKII nello stato on
altamente fosforilato è stato rimpiazzato da
oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non
è sufficiente a spingere il sistema nello stato
off. Il passaggio del sistema allo stato off
richiederebbe che la fosforilazione precipitasse
al di sotto del livello marcato con il punto
giallo (punto di equilibrio instabile).
NOTA BENE La CaMKII nella PSD può essere
defosforilata solo dalla PP1.
67
Un aumento della Ca2in aumenta la frequenza di
autofosforilazione.
Se la Ca2in è quella basale (bassa), il grado
di fosforilazione allo stato stazionario della
CaMKII è basso (cerchio nero nel
grafico). Successivamente, un ingresso di Ca2,
causato ad es. da stimolazione elettrica, può
muovere transitoriamente la Ca2in verso
destra, a valori molto più elevati.
68
Un aumento della Ca2 aumenta la frequenza di
autofosforilazione.
Se la Ca2in rimane per un certo tempo elevata,
a destra della regione grigia, lautofosforilazion
e farà saltare stabilmente lattività della
CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio
nero nel grafico). Successivamente, quando la
Ca2in ritorna a livelli basali, lo stato della
CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma
lattività della CaMKII permane comunque ad un
livello alto, con sostenuta autofosforilazione.
69
FINE