Presentazione di PowerPoint

1
Microchips nella diagnostica virologica
Dott.ssa Francesca Torricelli
Dott.ssa Sara Bernabini
SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliera
Universitaria Careggi, Firenze
19 Novembre 2004
2
(No Transcript)
3
Variazioni nel genoma umano
Ogni cambiamento nella sequenza del DNA
4
Variazioni nel genoma umano
5
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
È il più comune tipo di variazione genetica
6
Microarray
7
Tecnologia Nanogen
8
NanoChip electtronico
Each test site is electronically connected to the
NanoChip system by a platinum wire.
100 siti testo (pad) localizzati nellarea
centrale
Array 10x10
9
NanoChip electtronico
Ciascun pad presenta una connessione elettronica
individuale con il sistema (Nanogen NanoChipTM
Molecular Biology Workstation)
10
Campo elettrico
Larray è costruito in modo tale che i diversi
pad sulla sua superficie possano essere
selettivamente caricati positivamente Ogni
elemento del chip è indipendente dagli altri
Il trasporto selettivo degli oligonucleotidi e
dei prodotti di PCR viene effettuato applicando
una carica positiva ai pad selezionati
11
Trasporto selettivo
12
Trasporto selettivo
Ogni pad rappresenta un elemento indipendente del
chip
13
Trasporto selettivo
La tecnologia Nanogen è estremamente accurata
grazie al trasporto selettivo delle molecole
biologiche in posizione specifiche dellarray e
altamente versatile

14
Permeation layer
Sovrasta gli elettrodi Funziona da matrice per
lattacco dei prodotti di PCR o degli
oligonucleotidi biotinilati in quanto contiene
streptoavidina
15
Approcci possibili per lo studio di
mutazioni/SNPs noti mediante tecnologia Nanogen
Amplicon down
Capture down
16
Amplicon down
17
Disegno dei reporter
18
Rappresentazione grafica dei segnali fluorescenti
rilevati nei 100 pad
19
Identificazione genotipica
20
Protocollo di studio
21
Potenzialitaapproccio Amplicon down
1 SOLO PAD
22
Potenzialitaapproccio amplicon down
1 SOLO PAD
23
SEGNALI FLUORESCENTI DERIVANTI DALLO STUDIO DI 14
SNPs/MUTAZIONI IN CAMPIONI DIVERSI EFFETTUATO
SULLO STESSO CHIP 1372 CARATTERIZZAZIONI
Nonostante i numerosi step di ibridazione/strippin
g non è stato rilevato un incremento del
background
24
Ottimizzazione del protocollo
25
Approcci possibili per lo studio di
mutazioni/SNPs noti mediante tecnologia Nanogen
Amplicon down
Capture down
26
Capture down
27
MICROBIOLOGIA
28
MICROBIOLOGIA
I progressi nel campo della biologia molecolare
hanno messo a disposizione una serie di tecniche
(clonaggio, PCR, sonde di DNA etc.) che
prescindono dalla coltivabilità del batterio
29
Genotipizzazione di S. aureus
Approccio Amplicon down
30
Rivelazione degli agenti patogeni responsabili
della meningite

• Sonde specifiche per lidentificazione dei
  batteri
• (marcate con Cy3)
• Neisseria meningitidis
• Streptococcus pneumoniae
• Haemophilus influenzae

• Sonde specifiche per lidentificazione dei virus
• (marcate con Cy5)
• HSV1
• HSV2
• VZV

Approccio Amplicon down
31
Rivelazione degli agenti patogeni responsabili
della meningite
32
Identificazione dei micobatteri
Il genere Mycobacterium comprende oltre 100
specie ed il loro numero è in continuo aumento
in media tre nuove specie allanno sono state
descritte nellultimo decennio
Specie diverse sono caratterizzate da diversa
sensibilità ai farmaci
33
Amplicon down
34
Capture down
35
Mycobacterium tuberculosis
36
Mycobacterium tuberculosis
Valutazione della resistenza alla Rifampicina
Le due piu frequenti mutazioni genetiche,
responsabili di circa il 92 dei casi di
resistenza, sono sostituzioni nucleotidiche che
coinvolgono i codoni 526 e 531 e provocano una
sostituzione aminoacidica nella proteina
risultante
Cambio nucleotidico
Cambio aminoacidico nella subunita ? della RNA
polimerasi
La maggior parte delle mutazioni sono missense
Pochi casi di inserzioni e delezioni
37
Metodica SNPmine
Altro possibile utilizzo della tecnologia
microarray elettronico
Screening di mutazioni geniche associate alla
resistenza ai principali antibiotici utilizzati
nella terapia antitubercolare
38
Metodica SNPmine
Amplificazione delle sequenze wild-type
(campione reference) relative ai geni di
interesse un primer biotinilato, un primer
fluorocromato Cy3
39
Metodica SNPmine
Amplificazione dei campioni in esame (campioni
test) entrambi i primer fluorocromati Cy3
40
Metodica SNPmine
41
Metodica SNPmine
Lapplicazione della metodica SNPmine allo studio
della resistenza ai farmaci da parte di M.
tuberculosis permetterebbe di individuare
rapidamente i ceppi eventualmente resistenti
42
Farmacogenetica
Oggi di un farmaco si conoscono efficacia e
tollerabilità nella media delle persone, ma non
nel singolo individuo
43
Risposta ai farmaci
Efficacia raramente un farmaco ammesso in
commercio, e quindi valutato come efficace in
termini medi, lo e in piu del 60 dei pazienti
Tollerabilita le reazioni avverse a farmaci
sono la sesta causa di morte negli Stati Uniti 2
milioni di ospedalizzazioni/anno e 100.000
decessi/anno in seguito ad effetti collaterali di
farmaci correttamente prescritti
44
Farmacogenetica
Nasce per lesigenza di individuare, prima della
somministrazione del farmaco, quali soggetti
avranno una reazione favorevole e quali invece
sono a rischio di effetti collaterali piu o meno
gravi
45
Risposta ai farmaci
Soggetti diversi rispondono in modo diverso allo
stesso farmaco
46
Studio dei polimorfismi
Pazienti senza efficacia nei trial clinici
Pazienti con efficacia nei trial clinici
Predittivo di NON efficacia
Predittivo di efficacia
DNA wild-typeATCTGGATC Polimorfismo ATGTGGATC
47
Test farmacogenetici test predittivi
Non saremo comunque in grado di fare una
predizione assoluta, cioe dire con una sicurezza
del 100 se il paziente rispondera (o non
rispondera) al farmaco, se avra (o non avra)
effetti collaterali
E molto piu probabile che il risultato di un
buon test farmacogenetico sara del tipo il
paziente ha una probabilita molto alta (ad
esempio superiore all80) di rispondere bene al
farmaco ed ha una probabilita molto bassa (ad
esempio inferiore all1) di avere un effetto
collaterale
48
Farmacogenetica e microchips
Adatta a studi di farmacogenetica
49
Microchips nella diagnostica virologica
Dott.ssa Francesca Torricelli
Dott.ssa Sara Bernabini
SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliera
Universitaria Careggi, Firenze
19 Novembre 2004