Molekul

1
Molekulárna diagnostika infekcných ochorení CNS

• MVDr. Katarína Domaracká, PhD.
• MVDr. Monika Novikmecová
• MUDr. Iveta Fandáková
• MUDr. Zuzana Szövényiová

2
Princíp PCR-polymerázová retazová reakcia

• Polymerázová retazová reakcia (PCR, polymerase
  chain reaction) umožnuje selektívne zmnoženie
  (amplifikáciu) urcitej oblasti DNA spôsobom
  podobným in vivo DNA replikácii, pricom velkost
  amplifikovaného úseku ohranicujú dva
  oligonukleotidy primery.
• (1985, Kary Mullis)

3
Cielová dvojvláknová DNA
Mechanizmus PCR reakcie
Pociatocná denaturácia DNA 94-95C, 5
Annealing primerov 30-60C, 30
Primery sú predlžované prostredníctvom aktivity
Taq polymerázy
Nové retazce 74C, 2-5
ncykly sa opakujú
Denaturácia DNA 95C, 30
4
VZORKA
IZOLÁCIA DNA, RNA
AMPLIFIKÁCIA
DETEKCIA
5
Využitie PCR v diagnostike infekcných ochorení

• baktérie
• Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi,
• Mycoplasma sp., Chlamydia sp.,
• Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae,
• Mycobacterium sp........
• vírusy
• CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy
• papilomavírusy, hepatitída B a C...
• fungi
• faktory virulencie, gény rezistencie

6
CSF ako vzorka pre PCR

• jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri
  diagnostike infekcií CNS
• PCR- ideálna pre dg. tažko kultivovatelných
• mikroorganizmov
• možnost pozitívneho nálezu aj po aplikácii
  nízkych dávok antivirotík (inhibujú tradicné
  kultivácie)
• casová výhoda oproti sérologii (tvorba protilátok
  trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v case
  najvyššej replikácie

7
Senzitivita PCR v CSF

• nízka senzitivita (falošná negativita)
• príciny
• - nízka hladina vírusu vo vzorke
• - clearance- silné neutralizujúce protilátky
• - inhibítory produkty rozpadu erytrocytov
• !PCR neovplyvnuje xantochrómia, vysoká hladina
  bielkovín a leukocytov !!!

8
Špecificita PCR v CSF

• pozitívny výsledok indikuje prítomnost nukleovej
  kyseliny vírusu (súcasná alebo pretrvávajúca
  vírusová infekcia)
• Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú
  infekciu falošná pozitivita)
• - porušenie hematoencefalickej bariéry
• (bakteriálna meningitída, kontaminácia
  krvou)
• - prítomnost infikovaných Leu (CMV)

9
Diagnostika herpesvírusových infekcií CNS

• !Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových
  infekcií CNS!
• (DeBiasi a kol, 2004)
• problém pretrvávanie latentných
  herpesvírusov u zdravej populácie
• (ich genóm je ciel pre PCR)
• !Dôležité zvážit výskyt pozitívneho nálezu!

10
Herpes simplex vírus 1 a 2

• HSV1 aj HSV 2 najcastejšia komplikácia
  postihnutie CNS
• HSV1 najcastejšia endemická encephalitis v
  rozvinutých krajinách
• pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2) korešponduje
  vždy s klinickým obrazom a je gold standard pre
  diagnózu, s približne 96 senzitivitou a 99
  špecificitou (Boivin a kol. , 2004)

11
Kinetika HSV pozitivity v CSF

• prvotné štúdie pozitívny výsledok hned po
  infekcii
• novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok pocas
  prvých 72 h
• nevhodné hodnotit negatívny výsledok pocas prvých
  72 hodín, PCR test má byt opakovaný na 4 až 7 den
  po objavení symptómov
• nevhodné prerušit terapiu antivirotikami na
  základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil a
  kol, 2002)
• u pacientov so symptómami viac ako jeden až dva
  týždne simultánne PCR a sérologia

12
Vplyv terapie na PCR pozitivitu HSV v CSF

• Lakemann a kol. dlžka antivirot. terapie
• - 1 týžden žiaden vplyv na pozitivitu
• - 8-14 dní - 47 pozitivita
• - viac ako 2 týždne - 21 pozitivita
• ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po ukoncení
  terapie acyklovirom dalšia terapia (Cinque a
  kol. 2002)

13
PCR diagnostika CMV

• kvalitatívna latentní nosici
• moc,krv EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF
• plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny
• !Problém odlíšit latentnú a akútnu infekciu na
  základe PCR diagnózy!
• kvantitatívna PCR (real-time PCR)
• monitoruje fluorescenciu emitovanú pocas reakcie
  ako indikátor produkcie amplikónov v každom PCR
  cykle (v reálnom case)
• umožnuje kvantifikovat hladinu virémie v krvi,
  cím nepriamo monitoruje úcinnost terapie

14
EBV

• hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v CSF je
  stále nejasné
• DNA EBV je casto detekovaná aj pri absencii
  neurologických porúch
• Výnimka!
• AIDS - associated primary CNS lymfoma
• (citlivost 83-100 )
• (špecificita 88-100)
• (Boivin a kol. 2004)

15
CSF- manipulácia a odosielanie

• pre analýzu potrebné minimálne množstvá CSL,
  senzitivita závislá na objeme vzorky
• 200 - 300 ul ideálne množstvo
• optimálne - cerstvé vzorky dorucené co
  najrýchlejšie po odbere!
• krátkodobé skladovanie -20C, (1-2 dni)

16
Pomocou metódy PCR vyšetrujeme aj nasledujúce
patogény

• Chlamydia trachomatis
• Ureaplazma urealyticum parvum
• Mycoplasma spp. (MgeMhoMpnMfeMpe)
• HPV high risk (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45)
• Neiseria gonorhoeae
• Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia
  BAL)

17
Lymská borelióza (LB)

• Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA)
• Borrelia garini
• Borrelia afzelii
• rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité
  mikroaerofilné tažkokultivovatelné baktérie
• antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz)
• unikátna baktéria z mikrobiologického aj z
  molekulárneho hladiska (najviac plazmidov),
  umožnuje jej prežit v prostredí
• bezstavovcov aj stavovcov

Európa B. senzu lato
18
(No Transcript)
19
Nepriama - sérologická diagnostika

• 1. stupen (IF, ELISA) detekcia IgM a IgG
  protilátok
• - ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp.
  jeho konzervatívnu doménu C6
• - v ojedinelých prípadoch pozorujeme skríženú
  reaktivitu s EBV, iné herpetické
• alebo spirochétové infekcie
• 2. stupen IMUNO BLOT ( Western blot)
• - konfirmácia špecificity protilátok !!!!
• - v prípade nepriekaznej klinickej
  symtomatológie
• a pozitivity protilátok v sérologických
  reakciách

20
western blot- v prípade nepriekaznej klinickej
symtomatológie a pozitivity protilátok v
sérologických reakciách
Antigén p100 p58 BmpA VlsE OspC p41i DbpA
- IgM - OspC - tvorí sa po vniknutí do organizmu
Bicíkové proteíny
(flagelín p41) - IgG - VslE lipoproteín,zodpove
dá za únik pred imunitou má kozervatívnu
doménu C6 DbpA (Osp17, p18), DbpB OspA OspB
- povrchové proteíny ktoré borélia tvorí aby
unikla imunite kliešta, prípadne imunite hostitela
Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou
(Wilske a kol.2007)
21
LB-priama diagnostika

• PCR plazmidová, chromozomálna DNA
• biopsia kože, moc
• - v štádiách EM (erytema migrans) a ACA
  (acrodermatitis
• chronica atroficans) - vysoká senzitivita
• synoviálna tekutina vysoká senzitivita
• CSF - odporúca sa vo vcasných štádiách LNB
• - najvyšší záchyt DNA borelií je do 6 týždnov
  
• od výskytu prvých symptómov
  ochorenia
• - v neskorších štádiách neuroboreliózy
  senzitivita
• metódy klesá (EFSN guidelines,
  2010)

!!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚCA POUŽIT
KRV ANI SÉRUM!!!!!!!
22
Výhody PCR v diagnostike infekcných ochorení

• vysoká senzitivita (1-10 baktérií
• 10-100 PFU/vzorka)
• vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov)
• minimálne množstvo vzorky (výnimka moc)
• detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických
  infekcií
• detekcia tažko kultivovatelných mikroorganizmov
• rýchlost

23
Nevýhody PCR

• INTERPRETÁCIA
• informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna
  PCR!)
• ! to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke
  prítomná!
• neinformuje o
• - imunitnej odpovedi organizmu
• - citlivosti na antibiotiká
• detekuje aj prítomnost mrtvych mikroorganizmov vo
  vzorke (Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne
  po ukoncení liecby doxycyklínom, Bauwens a kol.
  1993)
• vysoké riziko kontaminácie pri odbere a
  spracovaní vzorky
• prítomnost inhibítorov vo vzorke (talk,
  heparín...), falošne negatívne výsledky
  (duplicita odberu)
• financná a technologická nárocnost

24
avilab_at_avilab.sk
Adresa Rastislavova 43 Košice Tel.
kontakt 055 / 615 23 74
615 23 75
615 23 76