Gen

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Genética molecular

• Organización, regulación y manipulación genética
• Dra. Mildred Jiménez

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Objetivos

• Comprender las bases moleculares de las
  mutaciones que conllevan a las enfermedades
  genéticas
• Usar tal información para mejorar diagnósticos y
  tratamientos

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I- Análisis de secuencias individuales de ADN y
ARN
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Limitantes iniciales

• Obtener cantidad suficiente de la secuencia de
  ADN o ARN de interés a ser analizada.
• Purificar la secuencia de interés dentro de todos
  los demás segmentos de ADN o ARNm presentes en la
  célula.
• clonaje molecular y PCR

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Clonaje Molecular

• Involucra la transferencia de una secuencia de
  ADN de interés a una célula o microorganismo.

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Cultivo del microorganismo Reproducción de la
secuencia de ADN introducida ADN
propio Aislamiento de las secuencias de interés
en grandes cantidades
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Enzimas de Restricción

• 1970s endonucleasa de restricción
  bacterianas (enzimas de restricción)
• Reconocen secuencias específicas de la doble
  banda del ADN y lo cortan cerca o en el sitio de
  reconocimiento.

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Enzimas de restricción

• Secuencias de 4 - 6 pb
• Secuencias palindrómicas
• 5-GAATTC-3
• 3-CTTAAG-5
• Extremos pegagosos o romos

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EcoRI

• Reconoce la secuencia específica de 6 pb
• Corta en cada hebra entre las bases G y A

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Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---GAATTC---3' 3'---CTTAAG---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---GGATCC---3' 3'---CCTAGG---5'
HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---AAGCTT---3' 3'---TTCGAA---5'
Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC 3'CTAG 5'---GATC---3' 3'---CTAG---3'
PovII Proteus vulgaris 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'---CAGCTG---3' 3'---GTCGAC---5'
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• La digestión de una molécula de ADN con una
  enzima de restricción determinada
• colección reproducible y característica
  de fragmentos de ADN
• refleja la frecuencia y localización de
  sitios específicos de restricción

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Implicaciones

• 1- Un solo cambio de una sola base puede abolir
  el reconocimiento de la enzima por el sitio y por
  lo tanto su capacidad de corte en ese determinado
  lugar
• 2- Toda las moléculas de ADN digeridas con EcoRI,
  tienen los mismos extremos pegagosos.

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Vectores

• Molécula de ADN que se puede replicar de forma
  autónoma en un huesped (célula bacteriana o
  levadura) del cual puede ser aislado de una forma
  pura para su subsecuente análisis.

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• Los vectores pueden alcanzar un alto número de
  copias por célula.
• Las bacterias y levaduras se pueden hacer crecer
  indefinidamente en un laboratorio
• grandes cantidades del ADN de interés
• El clonaje de fragmentos humanos de ADN en un
  vector por medio de enzimas de restricción y AND
  ligasa, permite la propagación del fragmentos de
  ADN clonado junto con la molécula del vector.

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ADN recombinante Nueva combinación de ADN
creada in vitro entre secuencias de interés de
ADN humano (u otro) y moléculas vectoras
bacterianas (u otras) capaces de duplicarse
indefinidamente dentro de una cepa de
laboratorio
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Vectores

• Plásmidos
• Bacteriófago Lambda
• Cósmidos
• BACs y YACs

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Plásmidos

• ADN circular doble banda
• Se replica extracromosomalmente
• En bacterias o levaduras
• Resistencia a antibióticos
• Segmentos cortos de ADN (hasta 15 kb)
• Selección
• pocos kb
• marcadores (resistencia a antibióticos)
• sitios de restricción

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Bacteriófago Lambda

• Virus bacterial
• ADN db relativamente largo (45kb)
• 1/3 de su genoma es no esencial
• Infecta las bacterias y se replica en la bacteria
  produciendo cantidades enormes de virus (hasta 1
  millón)
• Puede crear lisis bacteriana
• Segmentos de ADN de hasta 20 kb

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Cósmidos

• Plásmidos que utilizan la habilidad de las
  partículas infecciosas del bacteriófago lambda
  para empaquetar eficientemente piezas lineares de
  ADN y luego adherirse a la superficie de las
  bacterias e inyectar el contenido de ADN.
• Permite segmentos insertos de hasta 45 kb
• Secuencias Cos

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BACs

• Bacterial Artificial Chromosomes
• Plásmidos enormes
• 1990s
• Pueden contener insertos de hasta 300 kb

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YACs

• Yeast Artificial Chromosomes
• Vector con mayor capacidad (hasta 2000 kb)
• Se transfiere a Saccharomyces cerevisiae

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Librerías Genómicas

• 1- Digestión parcial del ADN genómico con una
  enzima de restricción.
• 2- Digestión del vector (misma ER)
• 3- Ligación del vector (ADN ligasa)
• 4- Introducción en célula huesped

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Librerías de ADN complementario

• Ventajas
• Representación directa de las secuencias
  codificantes (no intrones)
• Tejidos con expresión selectiva
• ADNc copias de la población de ARNm presente en
  un determinado tejido.
• Transcriptasa reversa

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Transcriptasa Reversa

• ADN polimerasa dependiente de ARN
• Derivada de retrovirus
• Requiere de primer para iniciar síntesis de ADN
  (oligo -dT). Oligo dT se une a la cola de poli A
  de los ARNm
• Niveles de ARNm transcripto

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Sondas de Acido Nucleico

• identificación del clon que lleva la
  secuencia de interés
• screening de una librería
• hibridización del ácido nucleico

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Marcadores (probes)

• A una secuencia X de ácidos nucleicos se prueba
  su complementaridad con un fragmento de ADN o ARN
  conocido y marcado (que se puede detectar).
• Marcaje
• Trazadores radioactivos (Fósforo 32)
• Compuestos histoquímicos
• Colorante fluorescente

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Hibridación

• Hebra simple desnaturalización
• Formación de dobles hebras hibridización a
  fragmentos de ADN marcados con secuencia
  nucleótidica equivalente

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II- Reacción en Cadena de la Polimerasa
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PCR

• Alternativa al clonaje
• Generar cantidades ilimitadas de una secuencia de
  interés
• Es una amplificación enzimática de un fragmento
  de ADN (blanco o molde) situado entre dos
  oligonucleótidos primers

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PCR

• ADN
• Primers le dan la especificidad
• ADN polimerasa
• Cofactores enzimáticos
• A,G,T,C

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Amplificación exponencial 2n n ciclos
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PCR reverso

• Amplificación a partir de ARN
• ARNm ADNc
  amplificación
• transcriptasa polimerasa
• reversa primers

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• Porciones particulares del gen (usualmente
  exones) se pueden amplificar utilizando primers
  específicos para el gen normal o el gen mutado.
• diagnóstico por amplificación
• diagnóstico por ASO en SB

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Ventajas del PCR

• Requiere poca muestra
• Rápida
• Barata (inversión inicial!!!)
• Sensibilidad y especificidad

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III- Métodos para el análisis de ácidos
nucleicos
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Southern Blotting

• Mediados de los 70s
• Método estándar para analizar la estructura del
  ADN digerido por enzimas de restricción
• 1- Aislamiento del ADN
• 10 ml de sangre gt 108 leucocitos gt 100µg de ADN
• 2- Digestión gt 1 millón de fragmentos
• 3- Separación de los fragmentos según su tamaño
  gt electroforesis en geles de agarosa

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• 4- Blotting
• A) desnaturalización (base fuerte)
• B) transferencia a un filtro de nitrocelulosa
  (blotting), por corriente eléctrica
• 5- Unión con una sonda marcada
• gt hidridación
• 6- Lavados
• 7- Revelado (exposición al revelador, placa de
  rayos X)

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Electroforesis en geles de agarosa

• Separa las moléculas por tamaño
• Fragmentos pequeños migran más rapidamente que
  los grandes
• Tinción con bromuro de etidio gt Fluoresce con
  luz UV

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NEGATIVO
POSITIVO
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Análisis con sondas alelo específicas

• Sonda sintética de oligonucleótidos ASO (Allele
  Specific Oligonucleotide)
• Corta longitud aprox. 20 pb gt sensible a
  diferencias en un par de bases
• ASOs para el alelo normal o para el alelo mutado
• Permite diferenciar homocigotas y heterocigotas

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• Porciones particulares del gen (usualmente
  exones) se pueden amplificar utilizando primers
  específicos para el gen normal o el gen mutado.
• diagnóstico por amplificación
• diagnóstico por ASO en SB

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Thompson Thompson Genetics in Medicine
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IV- Métodos para análisis de proteínas
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Western Blotting

• 1- Aislamiento de las proteínas de la muestra
• 2- Separación por electroforesis en geles de
  poliacrilamida
• 3- Transferencia a membrana
• 4- Incubación de la membrana con Ac anti
  -proteína en cuestión
• 5- Adición de un segundo Ac marcado
• 6- Revelado

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V- Análisis de la secuencia de ADN
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Secuenciación de Sanger

• Análogos de nucleótidos que inhiben la polimerasa
  
• Materiales
• ADN molde a secuenciar
• Primers
• ADN polimerasa
• dNTPs
• ddNTPs análogos marcados (fluorescencia o
  radiación)
• Electroforesis en gel de agarosa

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VI- Hibridación in situ de cromosomas
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FISH (hibridación fluorescente in situ )

• Cromosomas en metafase se fijan en portaobjetos
• Se desnaturalizan in situ gt se exponen las dos
  hebras del ADN
• Se hibridizan con sondas marcadas con un
  colorante fluorescente
• Se visualizan al microscopio de fluorescencia con
  una longitud de onda que y un filtro para
  observar el fluorocromo

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• Chromosome painting
• Parte de un brazo cromosómico
• Todo un brazo
• El cromosoma entero
• Spectral karyotiping (SKY)
• Análisis de telómeros / microdeleciones

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Mapeo por FISH

• Permite visualización directa de la posición del
  gen
• Regiones de 1-2 millones de pb (cromatina
  condensada)

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Un caso interesante de transferencia de genes se
ilustra en este experimento en el que aisló el
gen para la enzima luciferasa de las luciérnagas
y se incorporó en esta planta.
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Literatura Nelson D, Cox M. Lehninger Principles
in Biochemistry. Strachan T, Read A. Human
Molecular Genetics Nussbaum R, McInnes R,
Willard H. Thompson Thompson Genetics in
Medicine. Bases de datos http//www.ncbi.nlm.nih
.gov/ http//www.ensembl.org/