R

1
Rôle des isoformes de laminine dans la
différenciation des cellules epithéliales
intestinales

• Frédéric André, mai 2005
• frederic.andre_at_pharmacie.univ-mrs.fr

2
Épithelium

• -Tissu formé d'une ou de plusieurs couches de
  cellules qui recouvre le corps, les cavités
  internes ou qui constitue les glandes.
• -Les épithélium se caractérisent par
• des mécanismes d'adhésion
• leur différenciation qui leur permet de remplir
  un rôle spécifique (absorption, secretion
  ou de barrière)

3
La différenciation

• On appelle differenciation cellulaire des
  modifications qualitatives du phénotype qui
  résultent de la synthèse d'un nouveau produit
  codé par un gène.

4
Pourquoi l'intestin pour modele?

• Différenciation au cours de l'organogénèse
• Differenciation chez l'adulte le long de l'axe
  crypte-villosité

5
Organogénèse de l'intestin
6
Intestin adulte

• Principal organe d'absorption
• Barrière entre milieu extérieur et le milieu
  intérieur
• Possede de nombreuses modifications structurales

7
Structure de l'intestinLes replis transversaux
8
Structure de l'intestin les villosités
9
Structure de l'intestinles microvillosités
10
(No Transcript)
11
Les différentes zones
villosité
col
crypte
12
Les quatres principaux types de cellules

• Villosité cellules absorbantes, cellules en
  gobelet, cellules enteroendocrines
• Crypte cellules en gobelet, cellules
  enteroendocrines, cellules de Paneth

13
Les entérocytes
14
Devenir d'une cellule souche
MORT
Différenciation
Tris (rester dans les cryptes ou migrer?)
Spécification (absorbtion ou secretion?)
Prolifération
Auto-renouvellement
15
Cellules souchesdivision asymétrique
16
balance
prolifération
différenciation
17
La matrice extracellulaire
D'après de Duve C une visite guidée de la cellule
18
Une vieille expérience...Matrice extracellulaire
et différenciation
19
Cellules de crypte
PL
ECM
Cellules de villosité
PL
ECM
20
Les isoformes de laminine
21
Les isoformes de lamininedans l'intestin
22
Laminines et organogénèse
23
Laminin isoforms biological roles and effects on
the intracellular distribution of nuclear
proteins in intestinal epithelial cells

• INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France.

Turck N, Gross I, Gendry P, Stutzmann J, Freund
JN, Kedinger M, Simon-Assmann P, Launay JF.
Experimental Cell Research 303 (2005) 494-503
24
Ln-1
Rôle dans Ladhésion La prolifération La
différenciation
Ln-2
Ln-5
Ln-10
25
isoformes de laminine et adhésion des cellules
intestinales
26
conclusions

• Les isoformes de ln ont des effets differents sur
  l'adhésion et l'étalement des cellules.
• La ln -10 est la plus adhésive, suivie de la ln-2
  et ln-5 et de la ln-1.
• Les isoformes de ln sont donc distincts
  fonctionnelement.

27
ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION
28
Conclusions

• Morphologie des cellules clones plus petits
  lorsque les cellules sont déposéee sur ln-1.
  (cellules plus compactes sur ln-1)
• Prolifération ln-2, ln-5 et ln-10 mais pas la
  ln-1 augmentent la prolifération des cellules
• Ln-2, ln-5 et ln-10 fournissent des stimuli de
  prolifération.

29
ISOFORMES DE LAMININE ET DIFFERENCIATION
30
conclusion

• Seule la ln-1 induit la différentiation des
  enterocytes
• via l'induction du facteur de transcription
  cdx-2?

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Cdx-2 et differenciation

• Gene homeotique retrouvés dans lintestin.
• Transfection des cellules Caco-2 par
• Cdx-1 sens surexpression de cdx-1
• Cdx-1 antisens association avec l'ARNm de cdx-1
  endogène sous expression de cdx-1
• Cdx-2 sens surexpression de cdx-2

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Cdx-2 et differenciation
Courbe de croissance
Proteines
ARNm
33
conclusion
Cdx-2 induit la différenciation des cellules
intestinales
34
Conclusion générale

• Les isoformes de ln n'ont pas la même
  fonctionnalité.
• ln-1 induit la différenciation
• ln-2, ln-5, ln-10 stimulent l'adhésion et la
  prolifération

Les isoformes de ln participeraient à l'equilibre
prolifération/différenciation.
35
Autres systèmes cellulaires...

• La ln-1 induit aussi la différenciation des
  glandes mammaires...
• Elle contrôle la transcription des protéines du
  lait
• Le mecanisme fait intervenir STAT 5
• La ln-1induit aussi la différenciation des
  glandes thyroïde...via dautres facteurs de
  transcription

36
Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

• Etudes in vivo...
• Intégrines...
• Autres facteurs de transcription...
• Pathologies associées à un defaut de laminine...

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TD 2
38
Rappel
Migration Differenciation
39
balance
prolifération
différenciation
40
Un cas particulier la restitution intestinale
blessure
dédifferenciation migration
prolifération
différenciation
41

• Rôle important de la Matrice extracellulaire dans
  la différenciation intestinale.
• Mais elle nest certainement pas le seul stimulus
  de différenciation
• Autre hypothèse le processus est dirigé par une
  horloge moléculaire intracellulaire.

42

•   p27(Kip1) is an inducer of intestinal
  epithelial cell differentiation.Quaroni A, Tian
  JQ, Seth P, Ap Rhys C.
• Section of Physiology, Cornell University,
  Ithaca, New York 14853, USA
• Am J Physiol Cell Physiol. 2000
  Oct279(4)C1045-57.

43
Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI)

• Il en existe plusieurs p27 Kip1 (p27), p21
  Cip1/WAF1 (p21), p16
• Correlation entre lexpression de cki et le degré
  de différenciation.
• surexpression de p21 dans les cellules
  intestinales différenciées
• p27 dans les kératynocytes laugmentation de
  lexpression de p27 est concomittant avec la
  différenciation. Un oligonucléotide antisens de
  p27 inhibe la differenciation.
• Rôle de p27 dans la différenciation des cellules
  intestinales?

44
Méthode

• Utilisation de la lignée HIEC6 cellules issues
  de cryptes
• Surexpression par infection de
• Vecteur seul Adnull
• p16 Adp16
• p21 Adp21
• p27 Adp27

Analyse de la prolifération, des différentes
phases du cycle cellulaire, de la morphologie des
cellules, de lexpression de marqueurs de
différenciation
45
Contrôle de lexpression des ckis
Les cellules sont infectées à différentes
concentrations dadenovirus. Apres 24 heures
analyse des differentes protéines par Western blot
46
Contrôle de lexpression des ckis

• Analyse par immunocytochimie de lexpression des
  cki

47
Conclusions

• Linfection des cellules par ladenovirus cDNA
  exogène induit lexpression des ckis
• La surexpression de P21 entraine lexpression de
  P27 (P27 sous le contrôle de p21?)

48
Cki et prolifération
A1 jour après infection B effet dose de
ladenovirus sur la prolifératiopn C étude
cinétique
49
Brdu (bromodeoxyuridine)
Ac X-Brdu
Ac X-Ac X-Brdu
50
Cki et prolifération
A1 jour après infection B effet dose de
ladenovirus sur la prolifératiopn C étude
cinétique
51
Conclusions

• P16, P21 et P27 inhibent la prolifération
• de facon dose-dépendante.
• Plus défficacité pour P27, p21 puis P16
• Leffet de P27 est irreversible

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Surexpression des cki et cycle cellulaire
Pic G1
Nombre de cellules
Pic G2-S-M
Intensité de fluorescence Contenu en ADN
53
Cki et cycle cellulaire
54
Conclusions

• P16, P21 et P27 augmentent la quantité des
  cellules en phase G0/G1et diminue le nombre de
  cellules en phase S

55
Cki et morphologie
56
Conclusions

• Lexpression des CKI entraine
• p16 cellules polygonales mais pas de
  microvillosité
• p27 cellules polygonales avec presence de
  nombreuses microvillosités.
• p21 20-40 des cellules sont polygonales avec
  des microvillosité.
• p27 induit une differenciation morphologique

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cki et expression de la DPP IV
Proteine
ARNm
Activité enzymatique
58
cki et expression de la DPP IV
59
Conclusions

• p27et dans une moindre mesure p21 induisent
  lexpression de la DPPIV fonctionnelle.
  Localisation a la membrane plasmique.
• Polarisation??????

60
Comment faire pour déterminer si lexpression de
la DPPIV est polarisée?
61
cki et expression de lAPN
62
cki et expression de lAPN
63
Conclusions

• p27et dans une moindre mesure p21 induisent
  lexpression de lAPN.

64
En conclusion
65
Autres systèmes cellulaires...

• Premier article montrant le rôle de p27 dans la
  différenciation des cellules epithéliales.
• Et en 2005?
• Même rôle dans les cellules épithéliales
  bronchiques

66
Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

• In vivoIl existe dautres facteurs que les CKI.
  Souris KO pour P21 lintestin est normal.
• Cancer dans les carcinomes la P27 est souvent
  sous-exprimée. Cette sous expression est associée
  à une augmentation de lagressivité des
  cancers.Mêmes résultats pour prostate et estomac.

67
Pourquoi la surexpression de P21 induit la
différenciation
68
(No Transcript)