Desarrollo y optimizaci

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Desarrollo y optimización de un sensor óptico
para cuantificación y control de calidad de
soluciones de anticuerpos monoclonales

• Olga Rubio

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Sistema Inmune

• Sistema inmune conjunto de elementos especiales
  de un organismo, que le permite defender su
  integridad biológica frente a agresiones
  esencialmente externas (virus, bacterias, hongos,
  etc.) ? estímulo antigénico
• Anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig)
  proteínas producidas en respuesta a la
  inmunización del organismo con antígenos (Ag)
  Cada Ac reacciona específicamente contra el mismo
  antígeno que indujo su formación.

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Antígenos (Ag) y Anticuerpos (Ac)

• Los Ac se unen a los Ag por sitios llamados
  paratopes
• En los mamíferos se distinguen 5 Ac IgM, IgA,
  IgG, IgD e IgE que difieren en tamaño y
  propiedades.

• Los Ag son estructuras complejas cuyas
  superficies tienen diversos sitios que reconocen
  cada uno un Ac específico.
• Estas zonas se llaman epitopes o determinantes
  antigénicos pudiendo cada una, unirse a un Ac
  diferente.

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Estructura del anticuerpo
Las cadenas se unen por puentes disulfuro. Las
cuatro poseen una parte constante y una
variable. Las zonas variables, tanto de la
cadena L como H, poseen a su vez regiones en las
que se concentra la variabilidad tres
segmentos que forman las llamadas regiones
hipervariables o CDR
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Anticuerpos monoclonales (AcMo)

• Cuando se realiza una inmunización con el objeto
  de producir anticuerpos frente a un antígeno, se
  produce gran variedad de inmunoglobulinas (Ac
  policlonales) que poseen función de Ac frente a
  diferentes epitopes del antígeno.
• Los anticuerpos monoclonales son reactivos
  biológicos homogéneos en su actividad, en
  contraste con los antisueros convencionales
  (policlonales) que son una mezcla variable de
  inmunoglobulinas.

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Uso de los AcMo

• Caracterización y cuantificación de sustancias de
  interés biológico que se encuentran en cantidades
  muy pequeñas (hormonas, interferones, etc.)
• Identificación de antígenos presentes en las
  membranas celulares.
• En los trasplantes de órganos los AcMo dirigidos
  contra los linfocitos T, se utilizan en casos de
  amenaza de rechazo agudo.
• En Oncología para la localización de células
  tumorales y/o su destrucción.
• En la detección de grupos sanguíneos y estudios
  de fenotipo.

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Interacción Ag-Ac

• La zona por donde se unen Ag y Ac se
  encuentra a nivel de los puentes disulfuro
  intercatenarios de la molécula de Ac. (Zona
  Bisagra)

Los Ac se unen por enlaces no covalentes a los
epitopes de los Ag en sus sitios activos también
llamados paratopes.
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Características de la unión Ag-Ac
Especificidad de la unión Ag-Ac un Ac se une
fundamentalmente a un Ag determinado.

• Afinidad Interacción físico-química precisa
  entre el sitio de combinación de un Ac y un Ag.
  Se expresa a través de la constante de
  asociación. ka y kd son las velocidades de
  asociación y disociación.

Avidez fuerza total que considera todas las
interacciones epitope/paratope que tienen lugar
entre un Ag complejo y Ac multivalentes.
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Adsorción de biomoléculas en solución a
superficies sólidas

• Es la fijación a la superficie de un sólido, de
  moléculas, átomos, o iones (adsorbato), por
  ejemplo los que se encuentran en una solución
  puesta en contacto directo con esa superficie. El
  proceso inverso se llama desorción.
• Es resultado de la atracción entre las moléculas
  de la superficie del sólido adsorbente y el
  adsorbato.

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Quimisorción y Fisisorción
Experimentalmente se encuentran dos órdenes de
magnitud diferentes para la atracción que
produce la adsorción, indicando dos formas en
que las moléculas se pegan a las superficies

• Fisisorción o Adsorción física
• Interacciones débiles Van Der Waals, de
  atracción electrostática o atracciones dipolares
  entre sitios de la superficie y moléculas
  adsorbidas.
• Barreras del orden 0.3 a 1 kcal/mol.
• Tiempo de adsorción de ms a ms

• Quimisorción o Adsorción química
• Moléculas adsorbidas a la superficie como
  resultado de la formación de un enlace químico
  (muy fuerte comparado con las fuerzas de ligadura
  en la fisisorción)
• Tiempo de adsorción de s a hs

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Modelo de adsorción de Langmuir

• Todos los sitios de la superficie son
  independientes, equivalentes, distinguibles y de
  las dimensiones laterales de las macromoléculas
  adsorbidas y aisladas,
• las moléculas adsorbidas (adsorbato), sólo
  interaccionan con la superficie,
• las interacciones entre moléculas adsorbidas son
  despreciables por ser de corto alcance,
• el adsorbato forma una capa monomolecular sobre
  la superficie,
• las macromoléculas adsorbidas no se desplazan
  sobre la superficie.

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Representación simbólica del proceso de
adsorción

• Donde
• A indica una molécula de adsorbato,
• S indica un sitio de la superficie adsorbente,
• AS es el complejo adsorbato-superficie,
• ka es la velocidad de adsorción y
• kd es la velocidad de desorción.

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Factor de Recubrimiento
Fracción ocupada del total de sitios

• donde
• N es la cantidad total de sitios de
  adsorción
• X cantidad de sitios ocupados por moléculas
• adsorbidas

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Variación del recubrimiento
La adsorción y desorción sobre el sustrato,
ocurren simultáneamente en distintos puntos del
mismo

• La velocidad de
• adsorción de las
• moléculas a la interface
• es proporcional a la concentración de
  adsorbato en la solución, y a la fracción de
  sitios vacantes de la superficie

• La velocidad
• de desorción,
• es proporcional a la fracción de sitios
  ocupados de la superficie

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Cinética de Langmuir

• Si se expresa Ca como ?(x,t), donde
• x es la distancia a la superficie
• t es el tiempo de exposición de la solución a
  la superficie,
• las dos variaciones vistas se resumen en una

Aquí el primer término representa la contribución
al recubrimiento de la adsorción y el segundo de
la desorción
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Fenómenos coexistentes en la interacción de
solución y superficie

• La adsorción de moléculas a la superficie se
  realiza en
• ?a (?.. ka )-1
• La desorción, tiene un tiempo característico
• ?d kd -1
• La difusión generada por el gradiente de ?., se
  realiza con el tiempo característico
• ?D L2/D
• Donde L es la dimensión característica de la
  molécula y D es su coeficiente de difusión.
• Según los tiempos característicos de cada
  fenómeno el proceso resultante tiene los
  siguientes casos límite

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Límite de difusión rápida ?D ltlt ?a

• La deposición del Ac sobre la oblea, genera
  un gradiente en la concentración, que produce
  difusión hacia la interface, manteniéndose la
  concentración en la superficie ?(0,t) en el valor
  promedio ? resultando

donde
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• Límite ?D gtgt ?a

• Velocidad de adsorción controlada por la
  difusión
• En este caso, la adsorción domina frente a la
  difusión, siendo prácticamente inmediata la
  deposición total del Ac, y resultando el
  recubrimiento, dependiente del coeficiente de
  difusión de la macromolécula D

? (t) ? ? (D t)½
Para proteínas en solución, el tiempo de difusión
característico, varía en forma típica entre 0,1
y 100 ?s.
19
(No Transcript)
20
Elementos de un biosensor
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Clasificación considerando la Componente Biológica

• Sensores basados en enzimas
• Inmunosensores
• Sensores de ADN
• Sensores basados en receptores
• Biosensores de células aisladas
• De tejidos animales o plantas

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Clasificación considerando el Transductor

• Biosensores Potenciométricos (electrodos
  selectivos de iones o gases, FETs)
• Biosensores Amperométricos
• Biosensores Conductométricos
• Biosensores Ópticos
• Biosensores Potenciométricos comandables por luz
• Biosensores Térmicos
• Biosensores Piezoeléctricos

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Los Biosensores Ópticos se basan en la medición
de

• Absorción de la luz
• Emisión de la luz
• Light scattering (dispersión de la luz)
• Fluorescencia de la luz
• Reflectancia

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Inmunosensores

• Son biosensores que usan Ac como detector. El
  parámetro que se mide puede ser electroquímico,
  óptico, cambios térmicos, de masa, etc.
• La interacción del analito con la componente
  biológica del biosensor es registrada por el
  detector integrado.
• Se basan en reacciones inmunoquímicas, por
  ejemplo la ligadura del Ag a un Ac específico.
• La formación de los complejos Ac-Ag debe
  detectarse bajo condiciones en que se hayan
  minimizado las interacciones no específicas.

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Principios y Técnicas Ópticas utilizadas en
Inmunosensores
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Reflexión Total Interna - RTI

• Al incidir una OEM, sobre un material rodeado
  por otro de menor índice de refracción, a partir
  de un cierto ángulo de incidencia, llamado ángulo
  crítico, la luz es totalmente reflejada dentro de
  ese material, y es "guiada" a través de este
  medio, sin trasmitirse luz al medio de menor
  índice de refracción ( fibras ópticas)

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Onda evanescente

• Aunque el haz de luz que se propaga a lo largo
  de una fibra óptica, queda limitado a la región
  central de la misma, se genera una onda
  evanescente que penetra una d ? ? en el medio de
  menor índice de refracción, atenuándose
  exponencialmente. La adsorción de moléculas que
  se realiza en este medio ? cambio local del
  índice de refracción ? cambio en las condiciones
  de reflexión ? Estas variaciones son usadas como
  parámetro de medida.

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Espectroscopía de onda evanescente

• El campo electromagnético evanescente tiene una
  profundidad de penetración que depende de los
  índices de refracción de los medios y del ángulo
  de incidencia de la luz. Para luz visible, es del
  orden de 50 a 500nm.
• Debido a esto, un cambio en el medio de
  índice de refracción menor, influencia las
  características de la propagación.

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Resonancia plasmónica de superficie SPR
Al incidir un haz de luz monocromática
polarizada, el campo evanescente ? penetra la
lámina de metal ? excita ondas electromagnéticas
superficiales dentro de la región formada por los
electrones de conducción del metal (plasmones) ?
las condiciones para SPR son sensibles a las
variaciones de n.
30
Elipsometría
31
Elipsómetro
Utilizado para determinar el cambio del estado de
polarización de un haz colimado de luz
monocromática polarizada, producido por la
reflexión sobre una superficie pulida. Permite
registrar las variaciones de la intensidad de
luz reflejada por la superficie bajo diferentes
ángulos de incidencia, y en diversos estados de
polarización.
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Reflexión de una OEM

• Al incidir una OEM monocromática no polarizada
  sobre una superficie reflectante, la reflectancia
  varía según el ángulo de incidencia, observándose
  un mínimo en un ángulo llamado de incidencia
  principal (o de Pseudo Brewster para superficies
  conductoras o semiconductoras).
• El campo E de cualquier onda incidente, se puede
  descomponer en dos componentes una incluida en
  el plano de incidencia, o componente de
  polarización p y otra perpendicular al mismo o
  componente de polarización s.

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Polarización por reflexión bajo ángulo de
incidencia principal
OEM monocromática no polarizada, que incide bajo
el ángulo de incidencia principal la componente
p se trasmite, la componente s en parte se
trasmite y en parte se refleja. El rayo reflejado
y el trasmitido resultan perpendiculares.
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Onda de polarización p queincide bajo ángulo
principal

• OEM monocromática incidente polarización p bajo
  el ángulo de incidencia principal
• superficies dieléctricas ? Rmin 0
• superficies semiconductoras o conductoras ? Rmin
  ? 0
• Alteración de las condiciones de la superficie ?
  cambio en el índice de refracción de la
  interface ? aumento en la intensidad reflejada ?
  se puede emplear para detectar la adsorción de
  moléculas a la superficie.

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Esquema del inmunosensor óptico por
reflectometría láser
Haz láser incidente
Haz láser reflejado
36
Montaje Experimental
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Reflectancia de onda polarizada p, en incidencia
bajo ángulo principal, para diferentes superficies
l 633 nm
Semiconductor Mínimo no nulo
Dieléctrico Mínimo nulo
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Detección de biomoléculas por reflectometría

• Se basa en la medición de los cambios de
  reflectancia, desde una superficie puesta en
  contacto con dicha solución, debidos a la
  adsorción sobre la superficie, de biomoléculas
  en solución.
• Requisitos de la superficie
• plana y homogénea
• índice de refracción muy diferente del de las
  biomoléculas (para detectar fácilmente los
  cambios relativos de las intensidades de luz
  reflejada provocados por la adsorción de dichas
  biomoléculas).

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Mediciones de Intensidad Reflejada

• Intensidad láser reflejada en función del tiempo
  y curva correspondiente al ajuste de datos

gráfica corresponde al agregado de 80 ?g de
anti-AB monoclonal a la celda
40
Cinética de adsorción de anticuerpos
(1)
41
Casos límite
. Si t ? 0, (2) resulta
. Si t ? ?, (2) tiende a Imax, resultando
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Resultados Obtenidos
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Ángulo de Incidencia Principal para Interface
Aire-Silicio
44
Ángulo de Incidencia Principal para Interface
Si-solución fisiológica
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Curva de calibración

• Valores de f (C) para cada cantidad de anti-AB
  agregada

Constante de adsorción ka ( 7.2 0.5). 10-5
1/?g.s
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Determinación de una concentración incógnita

• Se determinan los parámetros P1, P2 y P3 y
  f(C) para una muestra incógnita, resultando
• f(C) (0.0198 0.0007) 1/s.
• Por interpolación sobre la curva de calibración
  se calcula la cantidad de AcMo adsorbido a la
  oblea
• C ? C (173 9) ?g
• Por método Colorimétrico se constata
• que la muestra usada contenía (180 10) ?g
  de anti-AB
• en la celda, valor que cae dentro del
  entorno determinado.
• la ausencia de AcMo en el sobrenadante, lo
  que indica
• que el total de proteína había sido
  adsorbido a la oblea.

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Aplicación a la determinación de una
concentración incógnita
f(C) (0.0198 0.0007) 1/s C ? C (173 9)
?g
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Obtención de la constante de desorción

• Teniendo en cuenta que

Resulta
Y en base a los valores promedio de f(C) y de P3
medidos se calcula la constante de desorción de
los AcMo empleados
kd ( 0.09 0.03) 1/s
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Discusión y conclusiones

• Los valores de f(C) y de P3 son independientes de
  la intensidad incidente en la interface oblea de
  Si-solución fisiológica. Por lo tanto, este
  método resulta independiente de las
  características de la fuente de iluminación.
• Las gráficas obtenidas de I vs t son muy bien
  aproximadas (Rgt0,94) con la función de la
  correspondiente a la cinética de adsorción de
  acuerdo con el modelo de Langmuir.
• El método permite obtener la concentración de
  anticuerpo en una muestra incógnita
• Se pueden obtener las velocidades de adsorción y
  desorción del Ac a la oblea de Si
• No es necesario marcado de la proteína
• Se puede usar con mínima cantidad de proteína