Presentazione di PowerPoint

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TeCoRe
Insegnamento CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE
Docente Prof. Daniele Fabbri Laboratori di
Scienze Ambientali via S.Alberto,
163 dani.fabbri_at_unibo.it Tel. 0544 - 937344
Materiale didattico Rubinson and Rubinson,
Chimica Analitica Strumentale, 2002. Fifield and
Kealey, Chimica Analitica, teoria e pratica,
1999. Lucidi disponibili on-line o presso
portineria sede.
2
PROGRAMMA PARTE PRIMA. Fasi di un procedimento
analitico Valutazione del metodo analitico.
Campionamento e preparazione del
campione Analisi quantitativa PARTE SECONDA
Spettrometria atomica FAAS GFAAS,
HGAAS,ICP-AES, ICP-MS. LABORATORI
strumenti di indagine bibliografica - uso banche
dati Analisi metalli assorbimento atomico.
Calibrazione esterna. Analisi acidi grassi gas
cromatografia. Calibrazione interna. Elaborazione
dati (EXCELL)
ESAME Orale. Discussione esercitazione in
biblioteca (articolo scientifico ottenuto da una
ricerca bibliografica). Discussione esercitazioni
di laboratorio (relazioni). Domande sul programma.
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CAMPIONE materiale per il quale è richiesta
uninformazione analitica
lot
campione porzione di materiale selezionato per
rappresentare un corpo più esteso di materiale.
sub-sample porzione del campione ottenuto per
suddivisione o selezione.
campione del laboratorio materiale inviato al
laboratorio per le analisi
campione test campione preparato partendo dal
campione di laboratorio
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
test portion il materiale pesato e sottoposto
allanalisi.
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
soluzione di misura
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Il campione deve essere

• RAPPRESENTATIVO la composizione è, nella sua
  globalità, identica a quella del materiale di
  partenza.
• OMOGENEO la composizione è la medesima in tutte
  le sue parti.
• INTEGRO non ci devono essere alterazioni durante
  il trasporto, la conservazione .(adsorbimento,
  volatilizzazione, )

altrimenti non si può mettere in relazione il
risultato finale con il materiale originale, non
importa quanto accurata sia lanalisi
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ANALITA il componente da misurare attraverso
lanalisi del campione
Specificare lidentità dellanalita. nome
comune nome commerciale nome IUPAC Chemical
Abstract Registry Number (CA RN) formula di
struttura nome della miscela, presenza di
isomeri, sottoprodotti?
esempio
DDT p,p-DDT diclorodifeniltricloroetano 1,1,1-tri
cloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (IUPAC) 1,1-(2,2
,2-tricloroetilidene)bis4-clorobenzene (CA) CA
RN 50-29-3 Trade Names Agritan, Anofex,
Arkotine, .,Santobane, Zeidane, Zerdane
struttura molecolare
Vedi esercitazione in biblioteca
6
MATRICE i componenti del campione chimicamente
diversi dallanalita.
Il termine MATRICE è usato anche per Indicare le
caratteristiche fisiche del campione (solido,
liquido, gassoso, organico, inorganico, ecc). La
natura della matrice e dellanalita definiscono
la procedura di preparazione e trattamento del
campione. Esempio

• ANALITA MATRICE TRATTAMENTO
• inorganico inorganica dissoluzione-digestione
• inorganico organica distruzione sostanza
  organica
• organico inorganica estrazione
• organico organica estrazione selettiva

Analysts are seldom lucky enough to be able to
inject samples with no pretreatment RE Majors,
LC-GC 2003
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INTERFERENZA effetto indesiderato di un
componente sulla accuratezza della misura di un
altro componente.
Esempi Interferenza da PAN nella determinazione
NOx nellatmosfera. NOx NO NO2 PAN
perossiacetilnitrato Si effettua misura NO per
chemiluminescenza, dopo che un convertitore ha
trasformato NO2 in NO. Il convertitore trasforma
anche il PAN in NO. Interferenza trascurabile
nelle zone urbane (NOx gtgt PAN), significativa
nelle zone rurali (NOxmax). Interferenza dei
cloruri nella determinazione ICP-MS
dellarsenico. Il cloruro produce nel plasma lo
ione 40Ar35Cl isobaro con 75As .
CONTAMINAZIONE introduzione non intenzionale
dellanalita o di altre specie nel campione
possibile causa di errore nella
determinazione. Spesso è irriproducibile ed
erratica. Esempio lavaggio della vetreria
inadeguato per lanalisi di metalli in tracce.
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GLI ERRORI
La storia contaminata. Concentrazioni di piombo
nellacqua di mare pubblicate dal 1938 al
1980. tratta da M.Stoeppler Ed. Sampling and
Sample Prep., Springer 1997
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Errori casuali originati da processi
incontrollabili e indeterminati, riducibili (ma
non eliminabili) con un lavoro attento,
presentano variazioni positive e negative,
misurati dalla deviazione standard s. Minore il
contributo degli errori casuali, più precisa la
procedura.
Errori sistematici (determinati) originati da
cause determinate con lo stesso andamento
(positivo o negativo), in principio eliminabili.
Misurati dal bias.
Errori grossolani. Errori di calcolo, lettura, .
10
RISULTATO il valore finale riportato per una
quantità misurata o calcolata dopo avere
effettuato la procedura di misurazione comprese
le opportune valutazioni.
numero unità di misura incertezza
ESEMPIO valore medio Xm deviazione
standard s , n (numero di misure) stima del
valore stima della precisione, n
Cifre significative Le cifre note con certezza
più la prima cifra incerta (qualunque sia la
posizione della virgola).l Lerrore di una misura
è rappresentato dallerrore sullultima
cifra. Gli zeri a destra delle cifre
significative sono significativi (se dopo la
virgola), a sinistra no (indicano lordine di
grandezza). 0.0410 tre cifre significative 650 tr
e o due cifre significative, meglio usare la
notazione scientifica 6.50102 oppure 6.5102
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LA PROCEDURA ANALITICA
definizione dellinformazione desiderata
ricerca bibliografica
scelta del metodo
strategia di campionamento
campionamento
subsampling campione per il laboratorio aliquote
per le analisi
omogeneizzazione conservazione
pretrattamento eliminazione interferenti forma
idonea per lanalisi
determinazione -bianco - calibrazione -
campione - RM, CRM
convertire i dati in risultati numerici
interpretazione dei risultati
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CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
volatilizzazione
fotodegradazione
attività microbica
ossidazione
rilascio di contaminanti
reazioni chimiche
adsorbimento
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TRATTAMENTO DEL CAMPIONE

• Trasformare analita/matrice nella forma più
  adatta alla tecnica danalisi
• Rimuovere interferenti
• Ottenere concentrazione ottimale

• Evitare contaminazione.
• Minimizzare perdite

Durante il trattamento del campione si possono
avere perdite di analita. La capacità della
procedura analitica di misurare la quantità reale
di analita presente inizialmente nel campione è
espressa dal recupero (recovery) R, recupero
Cmisurata/Cattesa100 Qmisurata/Qattesa100
La concentrazione C (o quantità Q) di analita
attesa può essere ottenuta dal valore certificato
di un CRM, oppure stabilita preparando un
campione fortificato. Il valore ideale è R
100 Se R lt 100 possibili cause perdite durante
le fasi di trattamento (filtrazione, ecc.) Se R gt
100 possibili cause contaminazione.
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Esempi di trattamento del campione

• METALLI
• Matrice acqua
• Filtrazione.
• preconcentrazione complessare il metallo con un
  legante organico per estrarlo in un solvente
  organico.
• Matrice solida
• digestione trattamento con acidi forti
  concentrati a caldo bomba per digestione se si
  formano prodotti volatili digestione assistita
  da microonde (Tlt 200C)
• Acidi utilizzati
• HNO3, H2SO4, HClO4 ossidanti, precauzioni se
  organici elevato.
• HCl complessante, in miscela con altri acidi.
• HF disgregazione totale silicati per analisi
  concentrazione totale.

• ORGANICI
• estrazione. (biota dopo saponificazione
  sedimenti) a riflusso soxhlet estrazione
  accelerata con solvente (ASE Tgt, Pgt, tlt, Vlt) con
  fluidi supercritici (SFE es.CO2).
• cromatografia su colonna per eliminare
  interferenti.

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criteri per la scelta del metodo analitico
FIGURE DI MERITO
precisione accuratezza (bias) sensibilità limit
e di rivelabilità selettività intervallo
dinamico
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VALIDAZIONE è il processo che permette di
dimostrare se i risultati ottenuti con il metodo
sono affidabili, riproducibili e se il metodo è
adatto per lapplicazione richiesta.

• Può essere effettuata tramite
• Confronto con un metodo differente sullo stesso
  campione (le fonti di errori dovrebbero essere
  differenti).
• Confronto con altri laboratori (partecipazione a
  studi inter-laboratorio).
• Uso di materiali di riferimento (certificati).

• Quando validare un metodo
• Viene sviluppato un nuovo metodo per risolvere
  un particolare problema.
• Si intende migliorare un metodo esistente per
  estenderlo ad un nuovo problema.
• Il controllo di qualita mostra che le
  prestazioni del metodo stanno cambiando.
• Si intende valutare la prestazione del
  laboratorio anche per un metodo esistente,
  utilizzato da un altro laboratorio, analista,

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materiali di riferimento - materiali di
riferimento certificati (CRM)
Reference material (RM) a material or
substance, one or more of whose property values
are sufficiently homogeneous and well-established
to be used for the calibration of an apparatus,
for the assessment of a measurement method or for
assessing values to materials. Certified
reference material (CRM) a reference material,
accompained by a certificate, one or more of
whose property values are certified by a
procedure. This procedure enables the materials
traceability to be established in terms of the SI
unit (to be understood as a mole of a
substance). Each certified value is accompanied
by an uncertainty at a stated level of
confidence. ISO guide 1991
Alcuni enti che producono (C)RM ASTM American
Society for Testing and Materials BCR Bureau
Communitaire de Reference IAEA International
Atomic Energy Agency NIST National Institute of
Standard and Technology NRC National Research
Council of Canada

• Come scegliere i crm
• Il materiale di riferimento dovrebbe avere una
  composizione simile a quella del campione (matrix
  matching)
• Contenere lanalita ad una concentrazione simile
  a quella del campione.

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PRECISIONE concordanza fra misure ripetute
Serie i risultati Xi di analisi ripetute
usando un solo metodo analitico su un materiale
omogeneo n il numero totale dei valori
misurati della serie. Il numero di repliche n va
sempre riportato.

Media (aritmetica) Xm SXi / n (X1 X2
X3 X4) / n
indici della precisione (imprecisione) della
misura Stima della deviazione standard s
S(Xi - Xm)2/ (n -1)1/2 Deviazione standard
relativa sr s / Xm errore standard della
media s/n1/2
numero minimo consigliato per una stima utile n
6
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Esempi di analisi replicate
Precisione del metodo
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Calcoli Ym 10.102 s 0.0130 rsd 0.13
Y1 10.09
Y2 10.11
Y3 10.09
Risultato Ym 10.10 0.013 n 5
Y4 10.10
Y5 10.12
conc. rame nella soluzione
diluizione 2 mL a 10 mL
digestione
20 mL 20 mL 20 mL 20 mL
misura
0.383 mg/L 0.377 mg/L 0.394 mg/L 0.380 mg/L
0.5344 g 0.4984 g 0.5003 g 0.5034 g
Risultato 75.4 ug /g 2.9 ug/g (RSD 3.8 )
n 4 oppure 75 ug /g 3 ug/g n 4
21
Ripetibilità s è riferito allo stesso metodo
sullo stesso materiale nelle stesse condizioni
(operatore, apparato, laboratorio) dopo brevi
intervalli di tempo. Riproducibilità s è
riferito allo stesso metodo sullo stesso
materiale in condizioni diverse (operatore,
apparato, laboratorio) e/o dopo lunghi intervalli
di tempo.
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem.
66(1994)595.
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Valore vero t valore ideale che si potrebbe
ottenere se tutte le cause di errore fossero
eliminate e lintera popolazione fosse
campionata. Valore ritenuto vero T (accepted
reference value conventional true value) valore
attribuito ad una quantità e accettato con un
incertezza appropriata per un determinato scopo.).
CRM T è il valore certificato
materiale FORTIFICATO (spiked) T è il valore
stabilito dallaggiunta dellanalita
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ACCURATEZZA (accuracy) concordanza tra il
risultato ed il valore vero T Laccuratezza è
un concetto qualitativo. Una misura è accurata
quando è precisa e libera da bias.
ESATTEZZA (trueness) vicinanza di accordo tra
il valore medio Xm ottenuto da una serie grande
di misure e T.
ACCURATEZZA
ESATTEZZA diminuita da errori sistematici
PRECISIONE diminuita da errori casuali
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Errore del risultato Ei Xi - T Errore
relativo Er E / T Errore relativo
percentuale Er() E/T100 BIAS E Xm - T
Ei (Xi - Xm) (Xm -T) Ecasuale
Esistematico(bias) In questo caso laccuratezza
indica una combinazione di errori casuali e
sistematici.
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem.
66(1994)595.
25
Bias del metodo tipico del metodo, lerrore si
presenta in qualsiasi laboratorio corrisponde al
bias di un test inter-laboratorio. Bias del
laboratorio comprende il bias del metodo e il
bias inerente al dato laboratorio.
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CALIBRAZIONE insieme di operazioni che
stabiliscono, sotto condizioni specificate, le
relazioni tra i valori delle quantità indicate da
un sistema di misura e i valori corrispondenti
realizzati da uno standard.
STANDARD di CALIBRAZIONE materiale con valori
noti della quantità Qst da misurare. Esempio
composto puro in un solvente.
STRUMENTO DI MISURA
segnale Yst
Qst
CONFRONTO. Calibration is comparison
RELAZIONE Q - Y
segnale Yc
STRUMENTO DI MISURA
CAMPIONE
Qc
Nota bene non confondere CALIBRAZIONE (
relazione tra segnale e misurando) e TARATURA (
accertamento funzionalità di uno strumento).
27
PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE
preparazione (ottenimento) degli standard
analisi degli standard
produrre il modello di calibrazione
analisi dei campioni
Y aX b
applicare il modello di calibrazione ai dati dei
campioni
ricalibrare regolarmente
Il modello di calibrazione viene utilizzato per
ricavare il valore di C del campione utilizzando
la funzione inversa MODELLO ANALITICO. X Y - b
/ a
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diluizioni seriali
1 mL qb a 200 mL
1000 mg Cu / L
1 mL qb a 100 mL
PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE
modello di calibrazione
soluzioni di calibrazione
segnale Y
misura
50.0 ugCu / L
solvente
Y 0.0158C 0.0045 R2 0.9981
0 uL 1000 uL 100 uL 900 uL 250 uL
750 uL 500 uL 500 uL 750 uL 250
uL 1000 uL 0 uL
bianco 5.00 ug/L 12.5 ug/L 25.0 ug/L 37.5
ug/L 50.0 ug/L
0.002 0.092 0.202 0.378 0.615 0.788
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ANALISI CAMPIONE
segnale
soluzione di misura
prelievo porzione test
misura
trattamento
0.513
modello di calibrazione
modello analitico
C (Y - 0.0045) / 0.0158
Y 0.0158C 0.0045
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la curva di calibrazione
INTERVALLO DINAMICO (dynamic range) del metodo
valori estremi di concentrazione C fra cui si
registra una variazione netta del segnale Y al
variare di C. INTERVALLO DINAMICO LINEARE valori
di estremi di concentrazione (LOQ-LOL) in cui il
segnale Y varia linearmente con la C.
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REGRESSIONE LINEARE loperazione per ottenere
la relazione lineare Yr b aCr che meglio
interpola i dati sperimentali
Yst, Xst ottenuti dallanalisi di N soluzioni di
calibrazione.
La retta ottimale è quella che minimiza la somma
dei quadrati dei residui S(Yst - Yr)2 ? valore
minimo
Y
Yr aXr b
PENDENZA (sensibilità) a S(Xst - Xm)(Yst -
Ym)/S(Xst-Xm)2 INTERCETTA b Xm - aXm
Yst, Xst
Ym SYst / N Cm SCst / N Xm, Ym centroide
X
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il modello di calibrazione
single-point calibration La calibrazione più
semplice è quella in cui si usa un solo
standard) Yst, Xst. Si assume Y 0 per X 0
risposta lineare da X 0 a X Xst
(estrapolazione oltre i valori Yst, Xst
sconsigliata).
Modello di calibrazione lineare Y aC b
SC Yb I chimici hanno favorito metodi con
relazioni lineari, causa difficoltà ad
interpolare curve. Ci sono metodi analitici
non-lineari (saggi immunologici).
Con lo sviluppo dei computer linterpolazione dei
punti diventa più semplice. Difficile trovare
equazioni su basi teoriche teoriche, perché la
non-linearità è dovuta a molteplici cause.
Relazioni empiriche Modello di calibrazione
polinomiale Y b aC aC2 aC3
problemi necessita più standard, maggiori
difficoltà nella valutazione dellincertezza,
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SENSIBILITÀ costante di propozionalità tra il
segnale ed il misurando
.S dY / dX pendenza della retta di calibrazione
Y a C b
è una misura dellabilità di un metodo di
distiguere piccole differenze di concentrazioni
dellanalita.
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esempio
Analisi del Si tramite AAS
251.61
251.61
intensità relativa
assorbanza
252.85
250.69
252.41
251.43
251.92
251.92
lunghezza donda, nm
concentrazione Si, mg/L
curve di calibrazione lineari per ogni linea
analitica.
linee analitiche del Si nellintervallo 250-253 nm
La sensibilità dipende dalla scelta della l di
misura
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CALIBRAZIONE ESTERNA
standard esterno analita nella soluzione di
calbrazione misurato separatamente dal campione.
Il campione contenente quantità ignote di analita
e le soluzioni di calibrazione contenenti
quantità note di analita standard sono
separate. Soluzioni di calibrazione preparate per
diluizioni seriali da una soluzione madre
concentrata. Composizione soluzione di
calibrazione simile alla soluzione del campione ?
? matrix matching Soluzioni del bianco. Es.
solvente puro (es. H2O), azzeramento dello
strumento. Soluzione del bianco procedurale (dei
reagenti) contiene tutte le sostanze usate nella
preparazione del campione alla stessa
concentrazione della soluzione di misura (il
valore va sottratto da quello del campione). (es.
soluzioni di HNO3/HCl) Matrix blank solution
contiene anche i costituenti della matrice (es.
sedimento).
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CALIBRAZIONE INTERNA
standard interno sostanza differente ma simile
allanalita (surrogato comportamento simile a
quello dellanalita). può essere aggiunto al
campione nella fase iniziale della procedura, in
fasi successive o nella soluzione di misura.
Scopo controllare un passaggio critico causa
di elevata incertezza. Rapporto
analita/surrogato meglio di analita
solo Fattore di risposta F analitaYs/surro
gatoYa Esempi surrogato Cd per Tl, Pd per Pt
spettroscopia atomica 57Co (radioattivo) per
59Co analisi radiochimica composto organico
marcato con 2H, 13C analisi MS appartenente alla
stessa classe (CH3(CH2)17COOH per acidi grassi)
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standardizzazione interna
Preparazione delle soluzioni di calibrazione. Lo
standard interno si trova alla stessa
concentrazione in tutte le soluzioni (e lo sarà
nella soluzione campione), mentre la
concentrazione dellanalita varia.
soluzione di standard interno
soluzione di analita
solvente
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RUMORE DI FONDO variazione indesiderata del
segnale, casuale e dipendente dal tempo (noise)
segnale non dovuto allanalita, costante o
lentamente variabile (deriva) (background). BIANC
O campione che non contiene analita
deliberatamente aggiunto, ma contiene tutti i (o
alcuni dei) componenti della procedura analitica.
Y
analisi del bianco
N noise misurato come differenza tra il valore
più alto e quello più basso (da picco a picco)
oppure come valore medio.
N
tempo
analisi del campione
S segnale (altezza del picco).
Y
S
Rapporto segnale su rumore S / N
tempo
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LOD - LIMITE DI RIVELAZIONE (limite di
rivelabilità, limit of detection) la quantità
di analita che produce il minimo segnale
significativamente diverso da quello del bianco.
Ylod Yb 3sb
Ylod
LOD
Yb segnale del bianco sb deviazione standard del
bianco
Ylod segnale del campione al LOD
40
determinare il LOD
LOD quella concentrazione che produce un rapporto
segnale su rumore S / N 3
dal rapporto segnale/rumore S/N
LOD 3sb / a
dalla retta di calibrazione Y aC b
dalla retta di calibrazione Ylod a LOD b LOD
(Ylod - b) / a ponendo b ? Yb LOD (Ylod - Yb
) / a sostituendo Ylod con la definizione di
LOD Ylod Yb 3sb LOD 3sb) / a
Y
b 3sb
b
C
LOD
41
Y a C b
il LOD dipende dagli effetti del fondo e dalla
sensibilità (a).
LOD 3s / a
LOQ 10 s / a
limite di quantificazione
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Selettività indica quanto il metodo è libero da
interferenze. Coefficiente di selettività
dellanalita A rispetto linterferente B K Sb
/ Sa. Specificità capacità del metodo di
distinguere tra lanalita e le altre
sostanze. Robustezza (robustness) capacità del
metodo di resistere alle variazioni delle
condizioni sperimentali.