Th

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Thème Culture et production de cellules
phytoplanctoniques. Réponses du phytoplancton
aux ajouts de contaminants métalliques.
Caractérisation structurale des exsudats
12 juin 2006

• - Laboratoire daccueil
• PROTEE-CAPTE (Toulon)
• Maître de stage
• M. C. Le Poupon
• Mme. Ortalo-Magne Annick,

Orateur MARZOUKI Mohamed
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Amélioration de la connaissance des phénomènes
chimiques dans lenvironnement côtier
but
Carbone organique extracellulaire (exsudat)

1. Cultiver et produire des cellules de diatomées

2 . Isoler et caractériser leurs polymères
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Intérêt de travail
Carbone organique extracellulaire (exsudat)

• importance écologique source dénergie

• causer des changements sur lécosystème

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Analyse des données bibliographiques
Secteur détude
La petite rade de Toulon - grande activité
humaine - industrie chimique - port commercial
et militaire
Apport conséquent en Contaminants variés
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Phytoplancton croit prés de la surface
première chaîne alimentaire la production de
la matière organique(MO) équivalent à lensemble
de la végétation terrestre puis de CO2 peut
avoir une grande influence sur le climat par
léchange de CO2
Analyse des données bibliographiques
La connaissance de trois termes suivants -
Phytoplancton - Polysaccharide - cuivre
Lumière pour la photosynthèse
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Polysaccharides - les plus abondants dans les
océans - présentent une grande surface active
permettant de jouer un rôle dans la fixation
des polluants métalliques il y a deux types de
polysaccharides - polysaccharides de réserve
source dénergie - polysaccharides structuraux
Cx(H2O)y)n- (où y est généralement x 1)
Analyse des données bibliographiques

• Cuivre
• - le plus complexé par la MO
• - on le trouve partout dans lenvironnement
• - Facile à analyser

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Méthodologies

1. Cultiver et produire des cellules de diatomées

Souche naturelle de diatomée
- Prélèvement rade de Toulon - Concentrer par
filtration inverse - Isolation par dilutions
successives - Repartir entre différents
erlen-meyer Dans un milieu f/2
f/2 Solution de sels nutritifs
Solution métallique Solution vitaminique
cylindrotheca Closterium
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Méthodologies
Le développement des cultures se fait - Chambre
thermostaté 17C - Éclairement contenu
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Méthodologies
Les Conditions optimales de la culture
Travail précédent M2 a permit dobtenir les
résultats suivants 1- la croissance algale se
fait selon 3 phases
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Méthodologies
2- la production de polysaccharides est maximale
à la phase stationnaire
Phase stationnaire
Pour obtenir le maximum dexsudation Travail dans
les mêmes conditions - dans une chambre
thermostatée 17C - Éclairement contenu -
larrêt de la culture à la phase stationnaire
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Méthodologies
Suivre la croissance et lexcrétion
phytoplanctonique - Létape de la croissance -
Concentration du carbone organique totale
1- Suivre la croissance - Comptage -
Concentration en chlorophylle-a
Microscope Fluorescence
2- Suivre lexcrétion dexsudats -
concentration de COD - concentration de glucose

analyseur TOC Spectroscopie UV-visible
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Méthodologies
Culture en phase stationnaire (7 jours)
Isolement
Arrêt de la culture par filtration (0,45 µm)
Filtrat
surnageant
Séchage
Extraction avec NaCl 1,5 M Agitation
Centrifugation 30/4C
Filtration 0, 45µm
Ultrafiltration, (dialyse concentration) 1kDa
Rotavapor
Partage CHCl3/MeOH/H2O
Phase aqueuse
Phase Organique
Ethnol. (4fois V)/4C/1 nuit
Centrifugation 30/4C
EPS liée
EPS libre
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Méthodologie

• Caractérisation structurale des exsudats

1- Spectrométrie de résonance magnétique
nucléaire (RMN) 2- Chromatographie en Phase
Gazeuse (CPG) 3- Voltampérométrie à
redissolution anodique (DPASV). 4- Spectre Infra
Rouge IR
1- Spectrométrie de résonance magnétique
nucléaire (RMN) - mettre en évidence lexistence
des polysaccharides - la différence de
structure entre les deux phases, particulaire et
dissoute - la différence entre les deux
milieux (sain et pollué)
2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) -
déterminer les compositions monosaccharidiques
- taux de glucides
4- Spectre Infra Rouge IR voir les groupements
fonctionnels qui peuvent complexer le cuivre
3- Voltampérométrie de redissolution anodique
(DPASV). - ladaptation des cellules aux deux
concentrations dun polluant métallique -
envisager le déroulement des mécanismes de
détoxification
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1- Culture et production de cellules
phytoplanctoniques.
ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
Témoin 0 Cu 3 erlen-meyer x 1L 500 ppb Cu 3
erlen-meyer x 1L 1000 ppb Cu 3 erlen-meyer x 1L
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
On considérer quil y a - Une culture
homogène - Une seule espèce
en réalité - Culture hétérogène - Il y a
dautres micro-organismes (bactérie.)
Pour avoir une bonne culture il faut -
Sélection par prélèvement contenu 4, 5 fois -
élimination des autres espèces (bactérie) -
Ajuster les facteurs influencent la culture
(lumière, température,.)
La disparition de COD dans la première
culture - Consommation bactérienne -
Précipitation
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
Isolement
masse polysaccharide masse polysaccharide
ppb Cuivre EPS libre EPS liée
la première culture (7 jours) Témoin 6,05 5,6
la première culture (7 jours) 500 8,02 8,17
la première culture (7 jours) 1000 6,9 1,84
la deuxième culture (11 jours 1 /2) Témoin 1
la deuxième culture (11 jours 1 /2) 500 2,15
la deuxième culture (11 jours 1 /2) 1000 1,55
La quantité augmente avec la de cuivre - 500
ppb Cu utilisation de polysacch pour la
détoxification - 1000 ppb Cu non adaptation au
milieu, mortalité
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
Spectre H-RMN
0 ppb Cu PES Libre
0 ppb Cu PES Liée
Il na y pas nécessité de se protéger la
quantité des EPS faibles
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
1- Spectre H-RMN
500 ppb Cu PES Liée
Différence - lintensité - lenvironnement
moléculaire
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
a temps de rétention Q la quantité de
chaque monosaccharide en µL R le pourcentage de
chaque monosaccharide - traces
monosaccharides non quantifiés
                                   
Arabinose Arabinose Arabinose Rahmanose Rahmanose Rahmanose Manose Manose Manose Xylose Xylose Xylose Galactose Galactose Galactose Glucose Glucose Glucose
                                   
a Q P a Q P a Q P a Q P a Q P a Q P
  0 1,06 0,03 3,41 1,12 0,49 50 1,12 0,11 11,2 1,1 0,11 11 1,1 0,12 12 1,1 0,1 5,54
ESP Libres 500 1,06 - - 1,12 0,74 74 1,1 0,07 7 1,1 0,15 15 1,1 0,2 35 1,1 0,1 10
  1000 1,06 0,09 9,11 1,12 0,49 50 1,1 0,14 14,9 1,1 0,34 34 1,1 0,35 35 1,1 0,2 15
  0 1 - - 1,13 - - 1,12 - - 1,1 - - 1,1 - - 1,1 - -
ESP Liés 500 - - - 1,12 0,42 42 1,1 0,06 6 1,1 0,04 4 1,1 0,13 13 1,1 0,1 11
  1000 1,06 - - 1,12 0,8 8 1,12 0,03 3 1,1 0,08 8 1 0,02 2 1,1 0 3
Identification des 6 monosaccharides (/
références) pour les 6 EPS La même origine
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
2- Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
xylose
Galactose
Glucose
La pourcentage augmente en milieu contaminé
EPS Liés renouvellement
EPS Libres Accumulation
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
3- Voltampérométrie de redissolution anodique
(DPASV).
Nous continuons encore à ajuster notre protocole
Cu 1000µM ESP 1mg/l
- les ESP ont une grande capacité complexante -
les ESP en milieu contaminé est plus complexant
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
4 Infra rouge (IR) 1- sur les cellules
Superposition des bandes déplacement de
certaines fréquence du fait de leur environnement
structurale Distinction nette est très
difficile des bandes
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
4 Infra rouge (IR) 1- Des cellules
Associés à des liaison de compléxation M-O (O
acide carboxylique)
Les fonctions structurales sont associées au métal
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS
0 ppbCu
500 ppbCu
1000 ppbCu
Absorption plus important quand la Cu
augmente Attribuée à lutilisation des fonctions
organiques dans Les liaisons M-O/O-M-O
Sont moins intenses Attribué à laugmentation de
la contribution des Bandes de vibration Métal-N
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ANALYSE DES DONNEES EXPERIMENTALES
4 Infra rouge (IR) 1- Des EPS
0 ppbCu
500 ppbCu
quasi-absent
1000 ppbCu
Existence da lacide uronique Absence des signaux
de CH2 et CH3(2924,2854) principalement
composé dacide uronique
Illustre bien la mobilisation des ses groupes
fonctionnels avec le Métal
quasi-absent
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Conclusions et perspectives

• Ce stage nous a permit

- amélioration des connaissances des cultures
- confirmation de certains résultats sur
lexsudation
- caractérisation structurale des polysaccharides
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Merci pour votre attention