Genski polimorfizmi i poligenske bolesti

1
Genski polimorfizmi i poligenske bolesti
2
Poligenske bolesti
fenotip
Geneticka osnova (više parova gena)
Faktori sredine
3
Geneticki-DNK polimorfizam

• Varijacije u naslednoj osnovi coveka
• Humani genom
• 3x109 parova svaki 1000.
  nukleotid
• nukleotida je
  polimorfan
• Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK
  koje se srecu u populaciji zdravih ljudi
• f alela gt 1, hetrozigoti gt 2
• predispozicija za bolest ???

4
Tipovi DNK polimorfizma

• Polimorfizam pojedinacnih nukleotida (SNP)
• Razliciti broj uzastopnih
• ponovaka (VNTR)
• Deleciono/insercione varijante

AAGGT C ili T GTTC
5
Studije asocijacije
Udruženost genskih polimorfizama sa nekom od
poligenskih bolesti.
Sklonost tj. podložnost!
6
Pristupi u izucavanju geneticke osnove
poligenskih bolesti

• Studije asocijacije

Ucestalost polimorfizma
bolesni
zdravi

Geni kandidati
Citav genom
7
Izbor gena-kandidata

• Na osnovu poznavanja etio-patogenetskih cinilaca
• Geni identifikovani u analizama vezanosti
• Geni identifikovani kod animalnih modela

8
Cerebralna venska tromboza

• DNK polimorfizmi
• Faktor V Laiden (Arg506Gly)
• f2,5 kod belaca
• Heterozigoti 7X veci rizik
• Homozigoti 80x veci rizik
• Protrombin (G20210A u 3 UTR)
• f2,4 kod belaca
• 3-7X veci rizik
• Oralni kontraceptivi
• 22x veci rizik

heteroz. Laiden
149X veci rizik!
9
Dijabetes melitus

• Tip I DM
• Udruženost sa HLA DR3 i DR4
• HLA DR haplotip
• Asp na poziciji 57 u DQ lancu
• Zašticeni od DM I
• Oboleli 90 homozigoti za DQ bez Asp!
• Još gt13 lokusa!!!
• VNTR u promotoru gena za insulin...

10
Alzheimer-ova demencija
Apo E polimorfizam
11
Alzheimer-ova demencija

• ApoE polimorfizam
• e4 alel PREDISPOZICIJA!
• ranije obolevanje (e4/e4, e4/e3) !
• 50-75 heterozig. NE OBOLEVA!
• drugi geni, faktori sredine...

SAD
Japan
genotip AD Kontr. AD Kontr.
e4/e4, e4/e3, e4/e2 64 31 47 17
e3/e3, e2/e3, e2/e2 36 69 53 83
12
a t e r o s k l e r o z a
13
Polimorfizam gena za ACE
egzon 16 egzon 17
Del varijanta
287 bp
Ins
DD genotip povezan sa KM, infarktom miokarda,

hipertenzijom ???
14
(No Transcript)
15
Metabolicki put folne kiseline i metionina

• Tetrahidro-folat
  metionin
• 5,10 metilen-
• tetrahidrofolat
  CH3
• MTHFR
• 5-metil-
• tetrahidrofolat
  homocistein

16
Polimorfizam MTHFR gena C677T (Ala222Val)

• Kodon GCT Kodon GTT
• Alanin valin
• Zamena u katalitickom domenu enzima
• Termolabilna forma enzima, disocijacija dimera
• Moguci genotipovi
• C/C normalan homozigot
• C/T heterozigot
• T/T homozigot za mutaciju 5-20 u opštoj
  
  populaciji

17
Polimorfizam MTHFR gena C677T

• Razlicita frekvenca alela T
• crna rasa lt bela rasa lt žuta rasa (efekat
  osnivaca ?!)

Evropa 0,24-0,4
Afrika 0,065
Australija 0,047
J. Amerika 0,19
18
Polimorfizam MTHFR gena i defekti nervne cevi

• Deficit folata - poznati faktor rizika
• Homocistein deluje i direktno teratogeno
• Majka TT 2-3x veci rizik za NTD (van der Put,
  1997.)
• MTHFR genotip deteta i majke
• prvi geneticki faktor rizika za NTD dokazan na
  molekularnom nivou (Christensen, 1999.)
• 677TT 20 (NTD) i 18 (m) (11 k)
• Oboje TT i/ili deficit folata - rizika

19
Polimorfizam MTHFR gena i defekti nervne cevi

• Korelacija sa tipom i lokalizacijom defekta
• (Wenstrom, 2000.)
• Cervikalni region
• Lumbalni region
• Okcipitalna encefalocela
• Anencefalija
• Egzencefalija
• Sakralni region

-
20
Uticaj polimorfizma MTHFR gena na fenotip

• Cinioci koji uticu na nivo homocisteina
• sredinski
• geneticki
• Osnova geneticke kontrole
• par kodominantnih gena L/H
• MTHFR C677T
• Regulacija je multifaktorska

pretpostavka
21
Studije asocijacije u citavom genomu(Genome Wide
Association Studies, GWAS)
22
Studije asocijacije citavog genoma(Genome Wide
Association Studies, GWAS)

• Simultana analiza gt10.000 SNP
• Microarray tehnologija
• (genski cip)

23
GWAS i Alzheimerova bolest
24
GWAS i Alzheimerova bolest
25
GWAS i Alzheimerova bolest
26
GWAS i Alzheimerova bolest
27
GWAS i Alzheimerova bolest
28
GWAS i Alzheimerova bolest

• Meta analiza 12 GWAS studija
• 5,043 ispitanika sa Mayo klinike
• (2,455 AB 2,588 K)

Investigation of 15 of the top candidate genes
for late-onset Alzheimers disease
Belbin et al, 2011
29
GWAS i Alzheimerova bolest

• BIN1, bridging integrator-1
• CLU, clusterin
• ili complement lysis inhibitor (CLI)
• CR1,complement receptor
• EXOC3L2,
• exocyst complex component 3-like 2
• PICALM
• phosphatidylinositol binding clathrin
• assembly protein

imunomodulacija
unutracelijski transport
30
GWAS i Alzheimerova bolest

• TNK1, tyrosine kinase, non-receptor, 1
• GAB2, GRB2-associated-binding protein 2 (adapter,
  aktivator fosfatidil inozitol kinaze 3)
• LOC651924
• GWA_14q32.13,
• PGBD1, piggyBac transposable element derived 1
• EBF3, early B-cell factor 3

PSEUDOGEN, slican sa Ubiquitin-like 1-activating
enzyme E1B
Regulator celijskog ciklusa, TSG
31
GWAS i Parkinsonova bolest
Simon-Sanchez et al, 2009, Nature Genetics
32
GWAS i Parkinsonova bolest
33
GWAS i Parkinsonova bolest
34
GWAS i Parkinsonova bolest
35
GWAS u PB meta analiza

• Evropska i americka populacija
• 5333 bolesnika i 12 019 zdravih
• 7 689 524 SNPs
• Replika 7053 bolesnika i 9007 zdravih

International Parkinson Disease Genomics
Consortium, 2011
36
GWAS u PB meta analiza

• 6 poznatih gena podložnosti
• MAPT,
• SNCA,
• HLA-DRB5,
• BST1, bone marrow stromal cell antigen 1
• GAK, Cyclin G-associated kinase
• LRRK2

37
GWAS u PB meta analiza

• 5 novih gena podložnosti
• ACMSD, aminocarboxymuconate semialdehyde
  decarboxylase
• STK39, serine threonine kinase 39
• SYT11, synaptic vesicle gene
• CCDC62/HIP1R, huntingtin-interacting protein
  1related gene
• MCCC1/LAMP3

38
Part B, Neuropsychiatric Genetics

• Association of GWAS loci with PD in China.
• Chang XL et al, april 2011.
• 636 pacijenata i 510 zdravih ispitanika
• Više SNPs u genima LRRK2 i SNCA udruženo sa PB
• PARK16 (1q32) niži rizik za PB u Kini
• Populaciona specificnost?

39
A genome-wide survey of human short-term memory

• 909.622 lokusa
• Faza 1 Švajcarska (333 ispitanika)
• Faza 2 Švajcarska (254 ispitanika)
• Faza 3 Nemacka (922 ispitanika)
• Faza 4 Srbija (523 ispitanika)

A Papassotiropoulos etal,
2010
40
A genome-wide survey of human short-term memory

rs6731900 rs565348 rs10930201
rs11235714
rs2278729
rs225344
Hromozom 2
11
21 Gen
SCN1A
41
Funkcionalna NMR
SCN1A (rs10930201) genotip
AC AA
42
"A genome-wide survey and functional brain
imaging study identify CTNNBL1 as a
memory-related gene"

• CTNNBL1 Beta catenin like protein 1
• Hromozom 20

A Papassotiropoulos etal,
, 2012.
43
Problemi kod studija asocijacije

• Nekonzistentnost rezultata usled
• Razlicite brojnosti ispitivanih populacija
• Geografskih/etnickih specificnosti
• Razlika izmedu polova
• Sadejstva gen-gen i gen-sredina

44
Missing heritability
B. Maher, Nature, 2008
45
Moguca objašnjenja

• Rešenje nam je pred nosom
• Odgovorne su retke varijante SNPs, koje GWAS ne
  analiziraju
• Kljucne su CNV (copy number variations) a ne SNP
• U pitanju je vrlo složena interakcija gena i
  sredine, kroz generacije...

46
(No Transcript)
47
Perspektive

• Korelacija sa klinickim i biohemijskim
  pokazateljima?
• Interakcija
• gen gen?
• gen faktori sredine?

48
Primena DNK analiza u identifikaciji osoba
49
DNK otisak identifikacija osoba
DNK fingerprint, otisak, profil Kombinacija DNK
polimorfizama karakteristicna za osobu.
50
DNK otisak identifikacija osoba
51
DNK otisak identifikacija osoba
52
Farmakogenetika
53
Farmakogenetika
pacijenti
Lek je toksican ali deluje
Lek je toksican i NE deluje
Ista dijagnoza, ista terapija
Lek NIJE toksican ali NE deluje
Lek NIJE toksican i deluje
54
Farmakogenetika

• Razvoj lekova i izbor terapije na bazi
• genetickih DNK varijacija
• 30 osoba ne reaguje na Th statinima
• 35 // b blokatorima
• 50 // triciklicnim
  antidepresivima

55
Farmakogenetika

• SAD
• 2 miliona hospitalizacija godišnje zbog reakcija
  na lekove
• gt100. hiljada ljudi umre

56
Farmakogenetika

• Uticaj polimorfizma
• Na metabolizam leka
• Enzimi...
• Na strukturu ciljnog proteina
• Receptor, enzim...

57
Genski polimorfizmi mogu da uticu na

• Dozu
• Efikasnost
• Toksicnost
• Farmakokinetiku
• Farmakodinamiku

58
CYP2D6

• Gen CYP2D6
• Superfamilija citohrom P450
• Protein debrisokin hidroksilaza
• Polimorfizam
• Utice na metabolizam gt25 lekova
• b-blokatori, neuroleptici, tricikl. antidepresivi

59
CYP2D6

• CYP2D6, 50 ALELA
• 5 alel, delecija citavog gena, gubitak enz.
  aktivnosti
• 2 alel, više kopija gena, ultra brzi metabolizam

Selektivni inhibitori serotonina
(SSRi) Tamoksifen
60
CYP2C19

• Gen CYP2C19
• Aleli CYP2C191 (wt), 2, 3 (nema enz. akt.)
• Genotip CYP2C19
• 1/1 (normalna akt.)
• 1/2, 1/3 (smanjena akt.)
• 2/2, 2/3, 3/3 (nema akt.)
• Specifican SNP cešci u Azijskim populacijama nego
  kod belaca!

61
Plavix (Clopidogrel)

• Nosioci varijanti CYP2C19
• ltnivo aktivnog metabolita
• 3,58x veci rizik za teške KV komplikacije
• kombinacija alela ?2, ?3 najveci rizik

Oznaka od 2010., gentski test!
Do 14 osoba u populaciji
62
CYP2C19

• CYP2C193
• Prevremeni STOP kodon
• Inhibitori protonske pumpe (Omeprazol,
  lansoprazol)

Th. H. Pylori (omeprazol i amoksicilin) CYP2C19
2/3 1/ 1 100 28,6 stope izlecenja
bolesti
63
CYP450

• AmpliChip CYP450 (Roche Diagnostics)
• Prvi test za CYP2D6 i CYP2C19 odobren od FDA
• Loš ili ultrabrz metabolizator
• Beta blokatori, antipsihotici, opijati,
  antikonvulzivi, PPIs

64
Varfarin (oralni antikoagulant)

• R-izomer i S-izomer
• Metaboliše ga CYP2C9
• ?2, ?3 aleli ltenz. aktivnost, gtconc. leka
• Inhibira VKORC1 (vitamin K epoxsid reduktase
  complex subunit 1)
• VKORC1 1173 C T, -1639 G A, 3673 G A

65
Varfarin
AA genotip lt doze
VKORC1 3673 G A
66
(Takeuchi isar., 2009.)
67
Varfarin

• Genetsko testiranje se preporucuje
• Na pocetku th
• Kod pacijenata ukljucenih u naucne studije
• Najbolja predikcija doze!
• Nije zamena za redovno pracenje INR!
• Cost benefit ?

68
Irinotecan

• UDP glukuronil transferaza 1A1 (UGT1A1)
• 1 alel (TA)6, normalna aktivnost
• 28 alel (TA)7, ltekspresija i aktivnost

FDA 2005. god.. oznacila lt doze kod
homozigota Za 28 alel!
Toksicnost Irinotecan-a, neutropenija, diarea! (i
nhibitor topoizomeraze I, Ca kolona)
69
Abacavir

• Inhibitor rev. transkriptaze (anti HIV)
• HLA-B5701 alel, gt rizik za hipersenzitivnu
  reakciju (50 svh HSR)
• Ucestalist alela 7,2 kod belaca, 2,8 u crnoj
  rasi, 5,6 kod ostalih

Aktivacija CD8 T celija Groznica, osip, GT
simptomi, mucnina, slabost, respiratorni
simptomi Stevens-Johnson sy., SLE, toks.
epidermalna nekroliza Lakticna acidoza,
hepatomegalija, smrt
2-8
Oznaka od 2008.!
70
TPMT

• Azatioprin i 6-merkaptopurin (ALL)
• Teška mijelosupresija zbog deficita
• tiopurin metiltransferaze
• Dati 1/10 doze!!!
• Postoji DNK test!

TPMT3A alel Dve nesinonimne zamene G A, Ala
Thr A G, Tyr Cys
71
DHPDH

• 5-fluouracil (Ca dojke)
• Teška neurotoksicnost zbog deficita
• dihidropirimidin dehidrogenaze
• Postoji DNK test

72
Th Alzhajmerove demencije

• Takrin (Alzhajmer)
• Reguju osobe koje nemaju e4 alel za ApoE!

73
Eticka i socijalno-medicinska pitanja

• Raspolaganje rezultatima
• poverljivost podataka
• odnos cene i koristi (cost benefit)
• pitanje etnicke i/ili rasne pripadnosti

74
Geneticke varijacije u ljudskim populacijama

• geneticke varijacije

gt
unutar populacije
izmedju populacija
93-95
3-5
pojam LJUDSKA RASA nema biološku definiciju!
75
BiDil

• Antihipertenziv
• Fiksna kombinacija
• Izososrbid dinitrat
• Hidralazin hidrohlorid

76
Personalizovana terapija

• Cilj farmakogenetike
• i farmakogenomike
• Terapija prema etnickoj i/ili rasnoj
  pripadnosti!?

77
Farmakogenetska istraživanja kod dece

• Više od 75 lekova koji se primenjuju kod dece
  nije testirano u pedijatrijskoj populaciji
• Veci rizik za neželjene reakcije!
• VULNERABILNA GRUPA, POTREBANE POSEBNE MERE OPREZA
  I ZAŠTITE

• Neophodno istraživanje
• Neposredna korist za dete
• Poverljivi podaci
• Informisani pristanak roditelja,
• uz saglasnost deteta
• Minimalan fizicki rizik za dete

Diskriminacija Stigmatizacija Uticaj na životne
izbore
78
Farmakogenetska istraživanja kod dece
ATF5 polymorphisms influence ATF function and
response to treatment in children with childhood
acute lymphoblastic leukemia Blood 2011
1185883-5890 Asparaginaza, regul. polim. U
basic region leucine zipper activating
transcription factor 5 (ATF5)
Phosphodiesterase type 4D gene polymorphism
association with the response to short-acting
bronchodilators in pediatric asthma
patients Mediators of Infllamation, 2011 key
regulator of b2-adrenoceptor-induced cAMP
turnover
79
Kompanije za analizu genoma pojedinaca
80
Podaci su poverljivi, nije dozvoljena
diskriminacija na osnovu genotipa
81
Farmakogenomika i edukacija

• PharmGenEd program edukacije za profesionalce
  (2008-2011)

82
Genska terapija
83
Genska terapija

• Def. tretman (lecenje) bolesti unošenjem
  genetickog materijala (DNK ili RNK)
• Vektori
• Virusi (retro, adeno, herpes)
• Ne-viralni (npr. lipozomi, genski pištolj )
• Tipovi genske terapije
• Somatska
• Genska terapija germinativnih celija

84
Strategije genske terapije

• POJACAVANJE DELOVANJA GENA
• (GENE AUGMENTATION -GAT)
• Uvodjenje dodatne kopije gena da bi se obezbedio
  produkt
• CILJANO UBIJANJE SPECIFICNIH CELIJA
• Kod maligniteta

85
Strategije genske terapije

• CILJNA INHIBICIJA GENSKE EKSPRESIJE
• Kod maligniteta, infektivnih bolesti (postoji nov
  ili neadekvatan genski produkt)
• Na nivou DNK
• RNK
• proteina
• POPRAVKA CILJNE MUTACIJE
• Na nivou DNK ili RNK
• Kod dominantno-negativnih mutacija

86
Tehnologija klasicne genske terapije
87
Tehnologija klasicne genske terapije

• PRENOS (TRANSFER) kloniranog gena
• Ex vivo kultura tkiva (SELEKCIJA !!!)
• In vivo preko vektora (EFIKASNOST ?)
• Problem VELICINE GENA
• Mini-geni (cDNK)
• Odnos unetog gena i nasledne osnove domacina
• Integracija u genom
• Ne-integrisana forma (epizom)

88
Odnos unetog gena i nasledne osnove domacina

• Gen se integriše
• Stabilna ekspresija
• Slucajna ugradnja

• Gen se ne integriše
• Kratkotrajna ekspresija

89
Vektori kod genske terapije





90
Vektori kod genske terapije
91
Protokoli za gensku terapiju kod ljudi
Infektivne bol. (SIDA) 12
Monogenske bol. (CF, SCID, DMD) 17
Kancer 69
92
Kriterijumi izbora bolesti za gensku terapiju

• Identifikovan gen
• Ne postoji drugi efikasan nacin lecenja
• Zahvacen (prvenstveno) jedan organ
• Postoji terapijski prozor u razvoju bolesti
• Postoji animalni model i uspeh terapije na
  humanim celijama in vitro
• Sigurna procedura

93
Rizici genske terapije

• Razvoj virusne infekcije kod viralnih vektora
• Npr. smrtni slucaj kod lecenja deficita OTK
  rekombinovanim adeno virusom (1999.)
• Integrisani gen dovodi do
• razvoja maligniteta
• Aktivacija protoonkogena
• Npr. LMO2 kod bolesnika sa X-SCID
• Inaktivacija tumor supresorskih gena
• gubitka funkcije važnog celijskog gena

94
Primeri razvoja genske terapije

• Deficit adenozin-deaminaze (SCID)
• Transplantacija kosne srži
• Nadoknada enzima (animalni,PEG)
• Genska terapija
• T limfociti iz krvi (1990.)
• Stem celije iz pupcane vrpce (1993.)
• celije iz kosne srži (2000.)

• Rhys Evans, SCID

95
Primeri razvoja genske terapije

• Hemofilija A
• Nadoknada faktora koagulacije
• Humani
• Rekombinantni (1990.)
• Genska terapija
• Virusni vektor unet in vivo, i.v. (1999.)
• Virusni vektor unet u kulturu fibroblasta kože
  trbušni zid (2001.)

96
Primeri razvoja genske terapije

• 37 god., blaga forma BMD,
• pokretan
• delecija egz. 17-48
• (46 kodir. regiona)
• cDNK za mini-gen

Duchenne-ova MD
Normalno DMD BMD
97
Genska th DMD regulacija ekspresije mutiranog
gena
strategija delovanje/efekat prednosti nedostaci perspektiva
Himerni oligo-nukleotidi Popravka mutacija u DNK Kumulativan, stalan efekat Niska efikasnost in vivo
Antisens oligo-nukleotidi Modifikacija splajsovanja pre-iRNK Sintetski mali molekuli, relt. sigurna procedura, restituišu se sve izoforme dys. Ponovljene aplikacije, oligonukl. specificni za mutaciju
Supresija prevremenog STOP kodona Prepoznavanje STOP kodona u iRNK, na ribozomima konvencionalni lek (gentamicin) Slaba reproducibilnost, sporedni efekti
98
Preskakanje egzona (exon skipping)
OUT-OF-FRAME DELECIJA
IN-FRAME DELECIJA
99
Preskakanje egzona (exon skipping)
DNK
RNK
obrada
G
AAAAAA
translacija
protein
100
Preskakanje egzona (exon skipping)
DNK sa del. egzona 50
iRNK out of frame nema sinteze distrofina
distrofin
101
Preskakanje egzona (exon skipping)
(K Foster i sar., 2006.)
Antisense oligonukleotid maskira out-of-frame
egzon
iRNK bez egzona 50 i 51 ponovo uspostavljen
okvir citanja
Skracen ali funkcionalan protein
distrofin
102
Preskakanje egzona (exon skipping)

• 2001-2003 in vivo
• 2005-2006 sistemska administracija

96 ekspresije u skletnim mm. 58 ekspresije u
srcanom m.
103
Preskakanje egzona (exon skipping)

• PRO051, Holandija 4 decaka, m. tibialis
  anterior(van Deutekom i sar.,
  2007)
• AVI-4658, Velika Britanija m. extensor digitorum
  brevis

sistemski unos, subkutano, 5 i 13 nedelja
(F. Muntoni K. Bushby, 2008.)
sistemski unos, 12 nedelja
104
Preskakanje egzona (exon skipping)

• Preparati
• PRO051
• AVI-4658
• koktel anti-sens oligonukleotida

za egzon 51, 13 DMD populacije
za egzone 45-55, 63 DMD populacije
problemi
Efikasnost unosa
Efikasnost dejstva
105
Preskakanje egzona (exon skipping)
Sadašnji rezultati
Željeni rezultati
106
Supresija prevremenog STOP kodona
DNK
RNK
obrada
G
AAAAAA
translacija
protein
107
Supresija prevremenog STOP kodona
DNK
RNK
obrada
G
AAAAAA
translacija
protein
108
Supresija prevremenog STOP kodona

• Gentamicin
• PTC124
• Kod point mutacija (5-13 bolesnika)
• Na ribozomima,koriguje se samo PREVREMENI STOP
  kodon

Distrofin pune dužine, samo 1ak promenjena!!!!
109
Supresija prevremenog STOP kodona

• Na animalnim modelima
• Klinicki trajali
• Dobra iskustva

110
Genska th DMD drugi pristupi
strategija delovanje/efekat prednosti nedostaci perspektiva
Transplantacija mioblasta Unos celija koje produkuju dys. Neinfektivno, relet. sigurna procedura Niska efikasnost, potrebna imunosupresija
Th maticnim celijama Unos celija koje produkuju dys. Konvencionalna, relt. sigurna procedura Niska efikasnost, potrebna imunosupresija
Povecana ekspresija utrofina Nadoknada dys. utrofinom Sintetski mali molekuli, relat. sigurna procedura Još uvek nije identifikovan specificni kompleks
111
Terapija maticnim celijama
Zigot totipotentan
Maticne celije pluripotentne
Diferencirane celije unipotentne

• razlikuju se po obliku,
• gradi i funkciji

112
Embrionalne maticne celije
kloniranje pluripotentnih maticnih (stem)
celija u cilju lecenja
113
Dr Duško Ilic, lekar i molekularni biolog 1960.
god., Vukovar
1964. god., Leskovac
114
Hvala na pažnji!