ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA

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ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA

• Servei de Microbiologia.
• Hospital Universitari Germans Trias i Pujol

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Introducción

• 8 millones de nuevos casos cada año,
• el 95 en paises en vías de desarrollo
• 2 millones de personas mueren anualmente
• 1/3 de la población mundial está infectada

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Relación huésped-parásito

• Llegada de M.tuberculosis a los alveolos
  pulmonares donde es fagocitado por los macrófagos
  alveolares.
• El bacilo es capaz de multiplicarse en el
  fagosoma y destruir posteriormente al macrófago.
• Los macrófagos segregan citocinas que atraen
  neutrófilos, linfocitos y macrófagos para que
  fagociten bacilos extracelulares, así como para
  generar un foco inflamatorio.

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Relación huésped-parásito

• Los linfocitos T CD4 específicos se transforman
  en linfocitos Th1 bajo la influencia de IL-12
  secretada por los macrófagos.
• Th1 segrega TNF- ? que permiten la llegada de más
  macrófagos, e IFN-? que activa a los que están
  infectados.

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Relación huésped-parásito

• Los linfocitos T?? también segregan IFN-? para
  activar macrófagos e IL-12 para que proliferen
  Th1.
• El macrófago sintetiza IL-12 que estimula a las
  cél NK que también sintetizan IFN-?.

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Relación huésped-parásito

• El IFN-? es la citocina efectora clave en el
  control de la infección micobacteriana mediante
  la activación de los macrófagos.
• IFN-? es la citocina esencial en el desarrollo de
  la inmunidad protectora contra M. tuberculosis.
• En combinación con TNF-? consigue unos efectos
  bactericidas del 90 de la concentración bacilar
  en los tejidos.

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Relación huésped-parásito

• Sin embargo, mientras se desencadena esta RI
  innata, los bacilos se van diseminando hacia los
  nódulos linfáticos regionales y los vasos
  sanguíneos.
• La RI específica consta no tan sólo de la
  proliferación de T CD4, sino también del estímulo
  de una sensibilidad retardada tipo IV (que se
  pone de manifiesto mediante TST).

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Relación huésped-parásito

• En un 5 puede originarse una enfermedad
  primaria.
• Pero, en un 95 de los casos suele resolverse el
  complejo primario, quedando M. tuberculosis en
  estado latente.
• En un 5 de estos casos, puede originarse una
  enfermedad posprimaria de reactivación durante
  toda la vida del huésped.

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Objetivos propuestos paracontrolar la
tuberculosis

• Pautas antibióticas más cortas y con menos
  efectos secundarios
• Una vacuna eficaz y accesible a toda la población
• Métodos diagnósticos rápidos, sensibles y
  específicos

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Métodos diagnósticos

• Un diagnóstico rápido y fiable de la tuberculosis
  constituye un elemento fundamental en las medidas
  de control de la enfermedad.
• Los métodos microbiológicos de referencia en el
  diagnóstico de la TB continúan siendo el examen
  microscópico, cultivo y aislamiento de M.
  tuberculosis y la detección de sus ácidos
  nucleicos.

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Métodos diagnósticos

• Se requiere de métodos diagnósticos para la
  detección de pacientes con el bacilo latente.
• Las personas infectadas con el microorganismo
  latente representan un peligro potencial de
  nuevos casos de TB.
• La única manera de controlar la TB es interrumpir
  la cadena de infección.

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Tuberculina

• La tuberculina (TST) es una prueba de
  intradermoreacción que permite la detección de
  individuos infectados
• Evitando el paso de infección a enfermedad.
• Rompiendo la cadena de transmisión.

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Tuberculina

• Evalúa la hipersensibilidad retardada que
  determinados compuestos antigénicos del bacilo
  provocan en el infectado.
• La tuberculina se obtiene del filtrado del
  cultivo de M. tuberculosis esterilizado y
  concentrado. Actualmente está constituido por un
  derivado proteico purificado (PPD).

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Tuberculina
Respuesta inflamatoria. Infiltración
perivascular linfomonocitaria.
Induración visible y palpable.
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Inconvenientes Tuberculina

• Algunos de los constituyentes proteicos del PPD
  son compartidos por micobacterias ambientales y
  por el bacilo vacunal (BCG).
• Falta de respuesta en pacientes con alteraciones
  de la inmunidad celular.
• Errores en la administración y subjetividad en la
  interpretación de los resultados.
• Visita de lectura. Conmoción social.

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IFN-? testNueva estrategia en el diagnóstico de
la infección latente

• Basándose en el fundamento de la tuberculina se
  han diseñado nuevas estrategias in vitro para
  evidenciar la sensibilización de las células T.
• Se han empleado diferentes antígenos
  micobacterianos para la estimulación de las
  células.
• Revelar la sensibilización mediante detección de
  IFN-?.

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(No Transcript)
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Fundamento de la tecnología
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Fundamento de la tecnología
Estimulación antigénica
Célula T
CPA
Liberación IFN-?
Determinacíon IFN-?
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Principales antígenos evaluados

• PPD
• ESAT-6 y CFP10

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Resultados empleando PPD como antígeno
67 ADVP. HIV pos y neg. Mayor concordancia TST y
IFN-? test en HIV positivos
253 voluntarios Etiopia. 35 concordancia TST y
IFN-? test 175 Baltimore. 68 concordancia TST y
IFN-? test
952 voluntarios
1226 adultos. 390 TST / 349 IFN-? test TST
/ IFN-? test -. 7x en vacunados
455 individuos. G1 Inmigrantes G2 Personal
Sanitario G3 TBC activa No diferencias en
extrapulmonar vs pulmonar ni si baciloscopia
positiva
Personal sanitario. 20 TST , 20 TST -
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ESAT-6 y CFP-10

• Early Secretory Antigen Target-6.
• Culture Filtrate Protein 10.
• Proteínas secretadas por M.tuberculosis complex.
• No está presente en la mayoría de micobacterias
  ambientales.
• No está presente en el bacilo vacunal (BCG).

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Especificidad de ESAT-6 y CFP-10
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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10
8 péptidos sínteticos de ESAT-6. Células
mononucleares. ELISPOT. En supuestos TST neg 3
pos/11 (338)
8 péptidos sintéticos de ESAT-6. Células
mononucleares. ELISA. Dinamarca. Etiopia. TB
11/34 (32,5) Contactos con TB 14/30 (466)
ESAT 6 recombinante. Células mononucleares.
ELISA Hª consistente con LTBI en presencia de
inmunidad
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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

• Pathan A et al. 2001. J. Immunol. 2001.
• Control no expuesto 0
• Convivientes expuestos 85
• TBC pulmonar 88-92
• La frecuencia de linfocitos T antígeno específico
  (ESAT-6) disminuyen con el tratamiento.

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Efecto tratamiento en IFN-?
RESPUESTA
TST
IFN-?
Carga Micobacteriana
TIEMPO
Infección
Enfermedad
Rx
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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

• Doherty T et al. J. Clin. Microbiol. 2002.
• Convivientes expuestos (24).
• Seguimiento de 2 años.
• Desarrollaron TBC (7)
• TST pos (7), IFN-? test pos (6)
• No desarrollaron TBC (17)
• TST pos (14), IFN- ? test pos (3)
• Indicador de riesgo de progresión a TBC.

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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

• Arend S. et al. J. Infect. Dis. 2002

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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

• Cardoso F.L. et al. Infect. Immun. 2002.
• Resultados positivos del IFN-? test
• 60 TBC
• 50 Leprosos
• 60 Pacientes control
• 59 Vacunados (todos TST pos)
• 36 de similitud de la ESAT-6 de M.tuberculosis y
  M.leprae.

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Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10

• Ewer K et al. Lancet. 2003.
• ESAT-6 recombinante y 12 pools de proteínas
  derivadas del ESAT-6 y CFP-10
• 89 de concordancia con la tuberculina.
• Correlaciona mejor que la tuberculina con
  exposición a M.tuberculosis en términos de tiempo
  (p0.007) y proximidad (p0.03).
• No correlación con vacunados con BCG (p0.44).

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Estudios comparativos PPD y ESAT-6
ESAT-6 Sangre total y ELISA 19 Vacunados 9
por PPD y 2 por ESAT-6
Vacuna a 60 estudiantes de Medicina. ESAT-6
Sangre total y ELISA
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Métodos in vitro estandarizados

• QuantiFERON-TB Gold
• ELISPOT

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QuantiFERON-TB Gold

• El QuantiFERON- TB Gold (QFN) es un método basado
  en la estimulación de sangre total mediante
  ESAT-6 y CFP-10.
• Determinación de la síntesis de IFN-? por las
  células T sensibilizadas mediante técnica de
  ELISA.

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Fase 1 Estimulación linfocitos T
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Fase 2 Determinación de IFN-?
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ELISPOT

• Método basado en la estimulación de células
  monocíticas extraidas de sangre periférica
  mediante la proteína ESAT-6.
• Determinación de la síntesis de IFN-? por las
  células sensibilizadas mediante técnica de
  ELISPOT.

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ELISPOT
Medio de cultivo con células y el antígeno
Anticuerpos específicos fijados a membrana
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ELISPOT
24-28 horas a 37ºC. CO2
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ELISPOT
- Anticuerpo secundario. 25h. TA. Humedad. -
Streptavidina-HRP. 2h. TA
40
ELISPOT
- Añadir sustrato cromogénico. - Incubar 15-70 a
TA.
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Lectura de los resultados

• Se considera positivo si el pocillo de la muestra
  contiene una media de 5 spot-forming cells más
  que el control negativo.

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CDC Guidelines para la utilización del QFN

• El test de la tuberculina y el QFN no detectan
  los mismo componentes de la respuesta inmune.
• Debe ser utilizado en laboratorios con
  experiencia en el test.

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(No Transcript)
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RecomendacionesCDC Guidelines para la
utilización del QFN

• Utilización
• Personas con elevado riesgo de infección latente.
• Personas con bajo riesgo de infección tuberculosa
  y sin factores predisponentes.

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RecomendacionesCDC Guidelines para la
utilización del QFN

• Confirmación del resultado de QFN
• Bajo riesgo QFN pos requiere confirmación por
  tuberculina. Si TST neg no quimioprofilaxis.
• Alto riesgo QFN pos requiere confirmación por
  tuberculina. Si TST neg, quimioprofilaxis a
  juicio clínico.
• QFN neg no requiere confirmación.

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ContraindicacionesCDC Guidelines para la
utilización del QFN

• En personas con sospecha de TB activa.
• En estudio de contactos de tuberculosos.
• Niños y jóvenes lt 17 a., embarazadas, o personas
  con patologías subyacentes que aumenten el riesgo
  de progresión a TB.
• No test confirmatorio de la tuberculina.

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Ventajas de esta tecnología

• No subjetividad en la interpretación.
• Posibilidad de repetir determinaciones.
• Resultados rápidos.
• Se elimina la visita de lectura.
• Controles de falta de respuesta inmune.
• De fácil estandarización.
• No interferencia con la vacuna BCG.

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Antígenos lipídicos y glicolipídicos Ulrichs T.
et al. 2003

• Se ha descrito un subtipo de cél T dependientes
  de moléculas CD1. Estas moléculas presentan
  antigenos lípidos y glicolipídicos. Las T que
  reconocen estos antígenos también producen IFN-?.
• Mayor respuesta frente a estos antígenos en
  individuos TST pos que en TST neg.
• Mayor respuesta en tuberculosos a las dos semanas
  de tratamiento que en el momento del diagnóstico.

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Conclusiones finales

• La detección de la infección tuberculosa mediante
  el test de la tuberculina es imperfecta.
• Se han realizado esfuerzos para la
  estandarización de técnicas in vitro basadas en
  la respuesta inmunológica del huésped frente al
  patógeno.

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Conclusiones finales

• Las técnicas actualmente disponibles se muestran
  como una posible alternativa al test de la
  tuberculina.
• Las investigaciones han de ir encaminadas a
  identificar nuevos antígenos específicos de
  M.tuberculosis para desarrollar técnicas in vitro
  para el diagnóstico de la infección tuberculosa
  aún más eficaces.

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Conclusiones finales

• Los nuevos tests no sólo deben discriminar entre
  individuos sensibilizados de pacientes vacunados
  con BCG y infectados con micobacterias
  ambientales, sino también de cualquier potencial
  nueva vacuna contra la TB.
• En el futuro próximo quizás dispongamos de una
  técnica de laboratorio que sustituya al TST en el
  control de la TB.

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(No Transcript)