DNA recombinante in a nutshell

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DNA recombinante in a nutshell
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Biologia Molecular Aplicada A tecnologia do DNA
recombinante

• Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

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Teoria bem fundamentada

• Por volta do início da década de 70, os
  fundamentos básicos da teoria já haviam sido
  propostos solidamente por Crick, Watson e CA
• Assim, os cientistas passaram a se perguntar
  será que o material genético e o processo de
  expressão podem ser manipulados?
• Ciência X (Bio)Tecnologia

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A descoberta da DNA ligase

• 1960 recombinação de DNA ocorre em células
• Reparo de danos ocorridos por luz UV
• 1967, Martin Gellert
• Extratos de E. coli produziam fagos lambda
  circulares
• Purificação da DNA ligase!
• Circularização de genomas

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Paul Berg

• Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda
• Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago
  lambda nele
• Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e
  incubou-os juntos, utilizando DNA ligase
• Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar
  covalentemente moléculas de DNA
• Como o bacteriófago era de E. coli e esta
  bactéria habita nossos corpos, ele teve medo de
  gerar um novo e letal vírus
• Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em
  biologia molecular
• Nobel, 1980 por seus estudos fundamentais em
  bioquímica de ácidos nucléicos, particularmente
  com relação ao DNA recombinante

Paul Berg, 1926-
Fago ?
SV40
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Endonucleases de restrição

• 1968, Paul Arber sugere a existência de enzimas
  existentes em bactérias que atuassem como
  proteção à infecção por fagos
• Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios
  específicas
• Endonuclease R
• 1968
• Meselson Yuan EcoRI
• 1970
• Smith Kelly nova endonuclease descoberta em H.
  influenzae -- HindIII
• Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta
  DNA exógeno mas não DNA celular
• Descoberta do sítio específico de corte pela
  enzima (AAGCTT)

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Mapa de restrição

• 1971 - Kathleen Danna and Daniel Nathans
• Ensaio de digestão Usam a endonuclease R (EcoRI)
  para cortar o DNA do fago SV40
• Fragmentos tinham tamanho constante e, logo,
  podiam ser facilmente separados em uma
  eletroforese!
• Verificado o fato de que a enzima corta em sítios
  específicos

EcoRI
HindIII
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
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Mapa de restrição moderno
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De novo, Berg
Extremidades cegas

• 1972, Bergs lab
• Janet Mertz and Ronald Davis descobrem que a
  endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre
  as duas fitas, gerando extremidades coesivas
  idênticas e complementares
• Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase
  poderiam gerar moléculas de DNA híbridas!

Extremidades coesivas
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Ensaio de digestão

• Adicione DNA tampão endonuclease de restrição
• Deixe digerindo num banho a determinada
  temperatura por determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição digere 1 µg DNA
  em 1h00
• Caixa de truques do biólogo molecular contém DNA
  ligase enzimas de restrição ...

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Vetores de clonagem

• 1970 Trabalho com plasmídeos
• Peças de DNA circulares e não cromossomais
  encontradas em bactérias
• E às vezes trocadas por elas
• 1970Descobriu um método segundoo qual uma E.
  coli adquiriria um plasmídeo conhecido como
  pSC101
• pSC101 contém um gene que confere resistência
  ao anti-biótico tetraciclina

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Plasmídeo encontra Endonucleases

• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas
  de restrição
• Trabalharam com dois plasmídeos,
• P1 confere resistência a tetraciclina
• P2 confere resistência a kanamicina
• Experimento
• Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição
• Incube-os com DNA ligase
• Teste a presença de bactérias duplamente
  resistentes no meio
• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro
  organismo recombinante feito propositalmente por
  um ser humano

EcoRI
EcoRI
P1
P2
EcoRI
K
T
Digestão ligação
K
P1/2
EcoRI
T
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Cohen Boyer

• 1973
• Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e
  verificaram que os genes estavam ativos nas
  bactérias depois de várias gerações
• Como as bactérias reproduziam-se rapidamente,
  poderiam ser utilizadas para produzir genes de
  grandes mamíferos em larga-escala
• Constroem um organismo capaz de combinar e
  replicar a informação genética de diferentes
  espécies!

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O que, então, era possível fazer?

• Era possível pegar o DNA de qualquer espécie,
  picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o
  amplificaria milhões de vezes
• A era da engenharia e da manipulação genética tem
  início...
• Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar?
• Verdade seja dita ninguém sabe ao certo...

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Engenharia genética

• Pode-se aumentar a expressão de um gene
  bacteriano
• Pode-se fazer bactérias produzir genes de
  qualquer espécie
• Expressão em levedura, células de mamíferos
• Produzir vírus transgênicos, produzir vírus
  contendo toxinas
• Terapia gênica, knockout gênico
• Que medo!?

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Discussões éticas

• 1974
• Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda ese
  arrependeu) alerta para o perigo da
  biotecnologia e sugere uma moratória
• 1975
• Conferência Asilomar
• Moratória de 16 meses ao DNA recombinante
• Bomba atômica da biologia?
• Watson acha que a natureza já fez muitos mais
  experimentos, por muito mais tempo e muitos mais
  jeitos do que podemos imaginar e nada de muito
  significativo aconteceu...
• Se fosse causar algum dano, a natureza per se já
  teria causado...

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Joshua Lederberg

• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma
  enzima)
• 1960Enquanto as discussões giravam sobre
  clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se
  desenvolveria através da microbiologia
• Lederberg defendia a terapia gênica e a
  engenharia de fenótipos
• 1974, AsilomarDefendia a tecnologia para
  diagnose de doenças, medicina terapêutica,
  produção de proteínas humanas em larga escala,
  processos de fermentação, produção maciça de
  antibióticos
• 1978, GenentechProdução da primeira insulina
  humana

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O DNA recombinante hoje

• Há centenas de vetores de clonagem comerciais,
  cada um com vantagens específicas (encontrar
  promotores, descobrir interações entre genes,
  expressar proteína em larga escala, etc)
• DNAs das mais variadas espécies são clonados a
  todo instante em laboratórios de biologia
  molecular em todo o mundo
• Parece que nada de muito anormal aconteceu...
  Ainda...
• Será que Watson está certo?

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Plantas transgênicas

• Genes de resistência a patógenos
• Resistência a inseticidas (Roundup)
• Aumento da produtividade, desequilíbrio ecológico
• Aumento nutricional
• Adição de determinado aminoácido torna alimentos
  mais nutritivos
• Banana vacina
• Rotulação!
• Prejuízo ecológico da monocultura
• A maior parte do prejuízo ecológico vem da
  simples monocultura
• A engenharia genética adiciona um nível de
  prejuízo ecológico ligeiramente maior
• É preciso diferenciar a tecnologia de
  transgênicos de seu abuso pela indústria do
  capital
• Produção de insulina, hormônio de crescimento,
  etc.

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Clonagem de genes

• Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

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Pra quê clonar genes?

• Amplificar milhares de vezes apenas este gene
• Realizar um estudo individual da função de genes
• Identificar mutações que modifiquem a função
  deles
• Entender a ação enzimática da proteína produzida
• Verificar com quais outros genes ele interage
• Produzir a proteína em larga-escala
• Montar genomas completos
• Produzir organismos transgênicos de interesse
• Etc etc etc etc

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Clonagem de fragmentos de DNA

• Enzimas
• enzimas de restrição
• DNA polimerases
• DNA ligase/Topoisomerases
• Fosfatases
• Vetores
• Plasmídios
• Fagos
• Cosmídeos
• BACS/YACS
• Vírus, bacteriófagos
• Hospedeiros
• Escherichia coli
• Levedura
• Células animais
• Células vegetais

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Vetor plasmidial

• Origem de replicação
• Gene repórter
• Sítio múltiplo de clonagem

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Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo

• Produção da molécula de DNA recombinante
• Plasmídeo DNA cortado do organismo de interesse
• Ligação das extremidades coesivas

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DNA Ligase

• Realiza a ligação fosfodiéster
• E agora, quem dirá de qual organismo é esta
  molécula?

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Ensaio de digestão e subclonagem
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Clonagem de fragmentos de DNA
INSERTO Fragmento de DNA
Ligação enzimática Ligase de DNA

• VETOR ou veículo de clonagem
• -plasmídeo
• -bacteriófago
• -cosmídeo
• cromossomo artificial de bactéria (BAC)
• cromossomo artificial de levedura (YAC)

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Amplificação do clone em bactérias
inserto fragmento de DNA ligado ao vetor
construção
introduzir nas células transformação e seleção
Objetivo Obter muitas Cópias do gene pretendido
bactéria transformada
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Transformação

• Inserção do plasmídeo em bactérias
• Replicação bacteriana
• Produção em massa da proteína recombinante!

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Métodos de transformação bacteriana
A transformação natural descrita por Griffiths,
em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é
um evento raro.
Permeabilização com CaCl2 -- Choque
térmico Eletroporação -- Choque elétrico Gene
gun -- Bombardeamento

• Plasmídeos pequenos são mais facilmente
  incorporados pela célula bacteriana competente.
• DNA linear é pobremente incorporado, talvez
  pelo fato de sofrer degradação pelas
  enxonucleases presentes no espaço periplasmático.

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Seleção de clones
Será que entrei?

• Bactérias são colocadas em meio nutritivocom
  antibiótico para que cresçam e amplifiquem nosso
  DNA do inserto
• Gene repórter
• Reporta se a transformação aconteceu
• Bactérias não-transformadasnão sobrevivem
• Gene de resistênciaa algum antibiótico

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(No Transcript)
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Seleção de recombinantes
Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase
pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto
tenha sido clonado. Para evitar a análise de um
vetor fechado é preciso um novo teste de gene
repórter.
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Keywords

• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA
  recombinante
• Vetor
• Sítio múltiplo de clonagem
• Genes repórteres
• Inserto
• Endonucleases de restrição sítio-específicas
• Digestão, ligação, clonagem

http//www.youtube.com/watch?vacKWdNj936ofeature
related
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Material Suplementar

• Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas
  aqui para a realização do trabalho de fim de
  curso http//www.genomenewsnetwork.org/resources/
  timeline/
• http//www.nature.com/milestones/miledna/timeline.
  html
• http//en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnol
  ogy
• http//www.nature.com/scitable/topicpage/Recombina
  nt-DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513
• http//www.nature.com/scitable/topicpage/Restricti
  on-Enzymes-545