Vy

1

• Vyšetrení parametru bunecné imunity
• Stanovení povrchových znaku lymfocytu a dalších
  bunek - vyšetrení subpopulací lymfocytu
  vyšetrení exprese molekul napr aktivacní znak
  HLA DR na monocytech pri monitorování pacientu
  v sepsi)
• Funkcní testy lymfocytu
• B lymfocyty- sledování produkce specifických
  protilátek (napr. proti
  tetanu)
• - merení koncentrace Ig
  v supernatantu stimulovaných
  B lymfocytu
• T lymfocyty test blastické transformace
  (aktivace lymfocytu),
  schopnost T lymfocytu reagovat na polyklonální
  mitogeny (PHA) nebo na
  specifický Ag (tetanický
  toxoid)

2

• Cytotoxicita NK bunek a T lymfocytu - stanovení
  funkce systému granzym/perforin, jde o složitou
  metodu, která je provádena na specializovaných
  pracovištích, musí být pripraveny efektorové
  bunky (TC, NK) a cílové bunky ( virem infikované
  bunky, nádorové bunky nebo APC prezentující
  testovaný Ag). Ke stanovení se používá
  radioaktivne znacený chrom.
• Fagocytóza
• k testu se používají mikrosférické hydrofilní
  partikule, nebo jiné substráty (Sacharomyces
  cerevisiae, stafylokoky). Poruchy fagocytosy
  mohou odrážet i poruchu opsonizace, prenosu
  signálu, aktivace nitrobunecných struktur a
  funkce kontraktilních mechanismu.
• Chemotaxe
• - schopnost fagocytujících bunek doputovat do
  místa zánetu
• - test in vivo Rebuckovo kožní okénko
• - test in vitro test v agaróze
  s chemoatraktantem a další

3

• Test oxidacního metabolismu
• - sleduje se schopnost fagocytu redukovat
  bezbarvé substráty na barevné diagnostika poruch
  v NADPH-oxidázovém systému
• Stanovení cytokinu
• - nejcasteji se stanovují IL-6 (pri podezrení na
  sepsi, trauma, srdecní selhání), IL-8 (jako IL-6,
  casná diagnostika ARDS- acute respiratory
  distress syndrom), TNF (typický pro syndrom
  systémové zánetlivé odpovedi)
• - urcení hladiny cytokinové mRNA pomocí RT-PCR
• - stanovení cytokinu metodou ELISA
• Test aktivace bazofilu
• - po aktivaci bazofilu alergenem se stanovujea)
  exprese aktivacní molekuly CD 63 pomocí prutokové
  cytometrie (BAT)
• b) mediátory (histamin, sulfidopeptidové
  leukotrieny) uvolnené pri degranulaci (CAST)

4

• Vyšetrení apoptózy
• - pomocí prutokové cytometrie ci fluorescencního
  mikroskopu (DNA se znací pomocí propidium jodidu)
  
• Typizace HLA urcení HLA antigenu na povrchu
  lymfocytu
• 1) Sérologická typizace
• - mikrolymfocytotoxický test
• - princip - inkubace lymfocytu s typizacními
  séry za prítomnosti králicího
  komplementu, poté je pridáno vitální barvivo,
  které obarví mrtvé bunky
• - bunky nesoucí urcité HLA
  jsou usmrceny cytotoxickými Ab
  proti tomuto Ag, procento mrtvých bunek je mírou
  toxicity séra (síly a titru
  antileukocytárních protilátek)
• - za pozitivní reakci se považuje více než 10
  mrtvých bb.
• (sérologickou typizaci lze provádet i pomocí
  prutokové cytometrie)

5

• 2) molekulárne genetické metody
• - pro typizaci se používají hypervariabilní
  úseky ve II. exonu genu kódujících HLA II. trídy,
  pro urcení HLA I. trídy se používá polymorfismus
  v II. a III. exonu kódujících genu
• 2a) PCR-SSP
• polymerázová retezová reakce se sekvencními
  specifickými primery
• - pozitivní a negativní reakce se hodnotí
  elektroforézou
• 2b) PCR-SSO
• PCR reakce se sekvencne specifickými
  oligonukleotidy
• - hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivne
  znacenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé
  alely
• 2c) PCR- SBT
• sequencing based typing sekvenování
• - nejpresnejší metodika HLA typizace
• - získáme presnou sekvenci nukleotidu, kterou
  porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel