Transzl

1
Transzláció prokariótákban
2
A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás
eros. k2 a SD és a transzlációs start kodon közti
távolság, és a régió másodlagos szerkezetének
függvénye.
3
A transzláció hatékonyságát meghatározó
elemektechnikai megközelítés
4
Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS
3'végéhez, pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz
operon) 10 x növekedés a termék
mennyiségében a SD szekvencia hosszának növelése
nem feltétlenül növeli a transzlációt Hasonlóan
a promóterekhez, túl eros kötodés a SD szekvencia
és a 16S rRNS 3 vége között a transzlációt
gátolhatja.
Transzlációs start kodon
5
Az AUG elotti szekvenciák
20x-os különbség UAU, CUU gtgt UUC, UCA, AGG ("-1
triplet) G-k kerülendok
Az AUG utáni szekvenciák
30x -oskülönbségek lehetnek AAA(Lys) gt AAG(Lys) gt
UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)... A természetes
gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala) transzláci
ós szabályozás a 2. kodonnal 10 régió AT gazdag
6
Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetosen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár
megengedett. - Génfüggo, egy gén esetén
általában csak kicsit változhat.
A köztes szekvencia összetétele
A jó, ha van (2x-es stimulus), C mindegy U
a "-4"-es pozícióban hatékony G gátol (3x-os
gátlás)
Upstream nemtranszlálódó szekvencia
Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása
megszünteti a transzlációt (ld lac). Minimum 10
bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötodnek
hozzá.
7
Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak, a
különbözo sejtféleségek különbözo gyakorisággal
használják az azonos aminosavakat kódoló
tripleteket. Ha a termeltetendo fehérje génjének
kodon használata nagyon eltér a gazdasejtétol,
akkor meg kell szintetizáltatni a gént a gazda
sejt preferenciájának megfeleloen. Alternatív
megoldás a gazdasejt kodon preferenciájának
megváltoztatása, ritka kodonokhoz tartozó tRNS
gének bevitelével
8
Kodon felhasználási preferencia táblázat
gbbct 50 CDS's (13879 codons)
egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján
a gén E. coli-ban, vagy élesztoben való
expresszálhatósága in silico becsülheto.
9
STOP kodon
UAA gtgt UGA, UAG Az esetek 80 -ában UAAU
10
KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER
1 Cisztronos rendszer
SD
5
3
ATG
struktúrgén
STOP
mRNS
2 Cisztronos rendszer
termeltetendo fehérje
1. SD
1. STOP
5
3
ATG
1. cisztron
ATG
2. cisztron
2. STOP
2. SD
mRNS
Az 1. cisztron tetszolegesen tervezhetú, de -
ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje
feleslegesen a sejtet (felesleges mutermék)
néhány aminosav - AT gazdag legyen a másodlagos
struktúrák elkerülése végett.
11
(No Transcript)
12
1 Cisztronos rendszer
SD
5
3
ATG
struktúrgén
STOP
mRNS
2 Cisztronos rendszer
termeltetendo fehérje
1. SD
1. STOP
5
3
ATG
1. cisztron
ATG
2. cisztron
2. STOP
2. SD
mRNS
Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron
Shine-Dalgarno szekvenciájához képest
meghatározó a transzláció hatékonysága
szempontjából.
PÉLDA bGH (marha növekedési hormon) Egy
cisztronos rendszerben lt 0.4 fehérje Két
cisztronos rendszerben 1. cisztron
...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron. elrendezodésbe
n 24 fehérje termeltetheto
13
Kifordított antiriboszómális kötohelyen alapuló
- rendszer
14
PROTEOLÍZIS
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási
mechanizmusa
E. coli-ban
Abnormális fehérjék, sejten belüli aggregátumok
ATP függo endoproteázok
polipeptidek lt 1500 Da
endoproteázok
aminosavak
peptidek
oldékony mono-, di- és tripeptidázok
15
La (Lon) a fo ATP függo proteáz

• 87 kDa egységekbol felépülo homotetramer,
• ATP és Mg2 függo, az ATP-áz aktivitás nem a
  polipeptid kötésfelbontásához, hanem a
  degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,
• in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez
  változhat, és ennél nagyobb.
• hasonló fehérjék elofordulnak magasabbrenduekben
  is, pl. egy májmitondriális proteáz
  immunológiailag keresztreaktív
• abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl.
  szabályozó fehérjék bontása)
• szerin proteáz, hidrofób jellegu szekvenciáknál
  hasít
• alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje
  hozzákapcsolódása aktiválja,
• a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez
  kapcsolódó szabályozás alatt áll
• ?32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

16
Proteolitikus ciklus
inaktív proteáz (4 ADP)
protein szubsztrát
4 ADP
4 PO43- 4 Mg 2
4 ATP - Mg2
alloszterikus aktiválás
aktív proteáz (4 ATP)
17
Genetikai vonatkozások
léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok
A lon- mutáció másodlagos hatásai   Poliszaharid
burok képzés (foleg alacsonyabb homérsékleten,
mint 34oC) Megoldás

• 37oC-on növeszteni
• galE struktúrgének inaktiválása
• cps (capsule) struktúrgének inaktiválása
• rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok

A lon mutánsok UV érzékenyek
DNS sérülés ? filamentáció Gazdag médiumon akár
letális is lehet ok SOS indukálható
sejtosztódás inhibitor SulA. Megoldás - ne
használjunk yeast extraktot, hanem tryptont -
sulA mutánsok
18
Ti (Clp) a másik ATP függo proteáz

• 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekbol álló
  heterodimer,
• ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa
  móltömegu
• ATP és Mg2 faktorok szükségesek
• hidrofób részeknél hasít, de a specificitás
  eltér a La-tól
• az alegységek külön multimerizálódnak
• HtpR szabályozás alatt áll

19
Genetikai vonatkozások

• Rendelkezésre állnak clp mutánsok
• a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt
  hatékony

Egyéb proteázok

• OmpT külso membránhoz kapcsolódó proteáz
• DegP periplazmatikus proteáz
•  
• T4 fág fertozés stabilizálja a fehérjéket
• pin gén terméke La inhibitor

20
Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre
E. coli törzs genotípus Kiindulási törzs Megjegyzés
lon mutánsok lon mutánsok lon mutánsok lon mutánsok
SG1117 Dgal Dlac lon-146DTn10 leu sup rec HB101 Tetraciklin rezisztens, jól transzformálható
SG12041 Dgal, Dlon-510 sulA recA C600 nincs filamentáció Rec-
lon htpR mutánsok lon htpR mutánsok lon htpR mutánsok lon htpR mutánsok
SG21163 Dlon-510 supFts htpRam165 MC4100 homérséklet érzékeny
lon clp mutánsok lon clp mutánsok lon clp mutánsok lon clp mutánsok
SG12044 Dgal Dlon-510 sulA clpA319Dkan C600 kanamycin rezisztens
lon clp htpR mutánsok lon clp htpR mutánsok lon clp htpR mutánsok lon clp htpR mutánsok
SG21173 Dlon-510 supFts htpRam165 DclpA319Dkan Dlac MC4100 kanamycin rezisztens, homérséklet érzékeny
21
FÚZIÓS FEHÉRJÉK
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a
fúziós partnerek génjeit a megfelelo leolvasási
keretben úgy klónozzuk össze, hogy az 5 vég
feloli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne
szerepeljen. Így egy polipeptidláncot kapunk,
amelyben a kiinduási fehérjék egymást követo
régiókként helyezkednek el.
ELONYEI
1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus
stabilitást jelenthet   2. Óriási elony a
tisztítás során, affinitás oszlopok   3. szignálpe
ptiddel való fúzió, szekretált fehérje
(limitált)   4. Az in vitro hasítás sokszor
pontosabb, intaktabb N-terminális szekvenciát
eredményez
22
Fúziós fehérjék oldhatósága
Oldhatatlan   "iclusion bodies" trpEII, vagy
cII, nincs proteolízis, differenciális
centrifugálással az "inclusion body" könnyen
tisztítható, probléma nem aktív fehérje pl
sometostatin, inzulin A, B, ellenanyag termelés
Oldható forma biológiailag aktív fehérje,
affinitás oszlopon való tisztítás problémák a
stabilitással, kevésbé jósolható
23
Egyéb hasznosítási lehetoségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió elonyei (ld.
késobb) a periplazmában, illetve az
extracelluláris térben oxidatívabb
környezet, diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF,
IGF A periplazmában az összfehérje 4-a
található, értelemszeruen kevesebb
proteáz,könnyebb tisztítás
2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így
a kívánt fehérje immobilizálható 3. funkcionális,
struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai
felhasználás alkalmasan választott fúziós
partner esetén nincs szükség hasításra. 4. megfel
elo hasítás után az intakt fehérje tetszoleges
biokémiai, biofizikai vizsgálata
24
A fúziós fehérjék tisztításának elve
25
A fúziós fehérjék típusai I.
I. Szekréció
Megjegyzés
pl. humán növekedési hormon alkalikus foszfatáz
szignál szekvenciával
II. Polimerizáció
fehérje-élettartam növekedés, pl. proinzulin 1-2
percrol 60 perc, IGF 200x-os növekedés
X
X
III. C-terminális fúzió
a fúziós partner intakt szabályozó régiója
használható, pontosabb proteolitikus hasítás
IV. N-terminális fúzió
amino terminális szekvenciák meghatározása, a
proteolititkus hasítás csonkot hagyhat a B
N-terminálisán
26
A fúziós fehérjék típusai II.
V. A szekréció és a C-terminális fúzió
kombinációja
a termék folyamatosan kinyerheto
affinitáskromatográfiával
VI. Kettos fúzió
nagy tisztaságú, nagy stabilitású
termék, hátrány két tisztítás, hasítás
szükséges
A
X
B
VII. Szekréció-inszerció
membrán fehérjék termeltetése a membránban
27
Fúziós partnerfehérjék
CAT klóramfenikol-acetiltranszferáz Z A
Protein A fehérje IgG kötô doménje PhoS
foszfát kötô fehérje MBP maltóz-kötô fehérje
GST glutation S-transzferáz TPEG
p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz APTG
p-aminofenil--d-tiogalaktozid.
28
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.
KÉMIAI
ENZIMATIKUS
aminopeptidázok 1 - 3 aminosavat hasítanak az
N-terminálisról
karboxipeptidázok 1 - 2 aminosavat hasítanak a
C-terminálisról
29
FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.
ENZIMATIKUS
Endopeptidázok
30
A fehérje szekréció
Nómenklatúra szekréció az extracelluláris
térbe export az sejtmembránokba vagy a
periplazmatikus térbe
Elonyei

• A tisztítás sokkal egyszerubb, esetleg folyamatos
  üzemu lehet
• Az periplazma illetve az extracelluláris tér
  sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding
•  
• A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértéku,
  proteolitikusanstabilabb termékek

31
Baktériumok membránszerkezete
32
SZEKRÉCIÓ E. coli-ban

• nem hatékony vagy nem teljes transzport a
  membránon keresztül
•  
• alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, ido
  elotti fehérjedegradáció
• ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs
  módosítása szükséges,akkor ennek hiánya

kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak
jó eredmények   nagy molekulák esetén problémák
lehetnek, pl az ER hiánya (módosítások
színhelye)   vannak fehérjék, amelyek nem
szekretálhatóak, esetleg letális, pl
-galaktozidáz fúziós fehérjék exportja
33
Fo protein transzport mechanizmusok bacteriumokban
Kotranszlációs transzport
SRP, signal recognition particle, és
receptoraE. coli homológ Ffh forty five
homolog, FtsY
Poszttranszlációs transzport
Sec útvonal egyszeru kofaktor mentes
polipeptidekre Tat útvonal több alegységes
enzimekre, amelyek kofaktorokat is
tartalmaz(hat)nak transzport a fehérje
összeszerelodése után
34
Sec útvonal E. coli-ban

•  
• - szignál szekvencia,
•  
• - szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep),
  Ala-X-Ala felismerohely
•  
• - szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák
  eltávolítása lipoproteinekrôl
•  
• - sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok
  felhalmozódásához vezet,
• Némi átfedés van közöttük.
•  
• - Régebben prl nómenklatúra is volt
•  
• SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belso
  membránkötött, ATP-áz aktivitás,
• kölcsönhatás a szállítandó fehérjével
•  
• SecB szekréció kompetens konformációért felelos
• SecYEFG a csatorna kialakításáért felelos
• SecD a periplazmatikus térbe való leválásért

35
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid
Lipoprotein szignál peptid
36
SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.
Gram-pozítív baktériumok

• a szignál peptid szignifikánsan hosszabb
• kiterjedtebb H régió

Eukarióták

• a H régióban a Leu dominál
• nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály
• a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav

az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli
export mechanizmusafelismer(het)i, illetve
fordítva
37
A Sec függo fehérje transzlokáció modellje E.
coli-ban
38
A Sec útvonal - másképpen
39
A Sec útvonal - másképpen
40
A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok
összehasonlítása
41
Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal
membrán fehérjékre jellemzo
A Sec és az SRP közötti választás trigger
faktor
42
Signal sequences for targeting
Sec szignál peptid
n-region
c-region
h-region
SRP erosen hidrofób szignál, nem hasad le
Twin-arginine szignál peptid
moderáltan hidrofób

N
S/T-R-R-x-F-L-K
n-régió
c-régió
h-régió
43
A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise
citoplazmatikus összeszerelodési modell
Holoenzim
Periplazma
csatorna
Citoplazma
szignál peptid
kofaktor(ok)
prekurzor
44
The twin-arginine translocase (Tat) proteins
45
A TAT modell