SUPERCOMPLEJOS

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SUPERCOMPLEJOS

• Villanueva Alonso, Óscar
• Calvo Morales, Maria Dolores

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La mitocondria
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DNA mitocondrial

• El mtDNA es una molécula de doble hebra de DNA
  circular
• El mtDNA no tiene intrones y los tRNAs sirven
  como elementos de procesamiento
• Tiene sus propios ribosomas
• El mtDNA posee su propio código genético

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Características del mtDNA

• Herencia materna
• Las mitocondrias se heredan exclusivamente de la
  madre
• Poliplasmia
• Cada célula con entre 100 y 10.000 copias de
  mtDNA dependiendo del tejido
• Alta tasa de mutación
• El mtDNA presenta una tasa de mutación espontánea
  10 veces superior a la del DNA nuclear
• Segregación mitótica
• Homoplasmia
• Heteroplasmia

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Dificultades de la genética mitocondrial en
animales

• El mtDNA no es manipulable in vivo
• No se pueden transformar mitocondrias
• No se puede realizar mutagénesis dirigida.
• El mtDNA de una especie es incompatible con el
  nDNA de otra.
• No se pueden hacer estudios de genética funcional
• Dificultad en la generación de modelos animales
  de patologías mitocondriales

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RESPIRACIÓN AEROBIA cadena de transporte de
electrones
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Solo unas pocas subunidades de los complejos
respiratorios están codificados por el mtDNA
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Estructura de los complejos
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MODELOS

• estado líquido
• todos los componentes de la cadena de electrones
  difunden libremente en la membrana interna de la
  mitocondria y la transferencia de electrones
  entre unos y otros depende de encuentros a azar
• estado sólido
• los complejos están asociados permanentemente
  formando supercomplejos

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Ventajas de los supercomplejos

• Estabilización de la estructura de los compuestos
  individuales
• Canalización de los reactivos intermedios
• La ubiquinona y el citocromo c pasan directamente
  de un complejo al siguiente
• Secuestro de las especies intermedias
• Se evita que puedan reaccionar con el O2 para dar
  radicales libres

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a) supercomplejo I1III2 b) supercomplejo I1III2IV1
Schägger et Peiffer (2001) JBC, 276, 37861-7
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Modelos para la estequiometria de los complejos
Schägger et Peiffer (2001) JBC, 276, 37861-7
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Estudio de la interrelación entre el CI y el CIII
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• Observaciones
• Pacientes con intolerancia al ejercicio con
  deficiencias en el CIII en el tejido muscular
• Deficiencias en el CIII pueden que pueden cursar
  solas pero suelen hacerlo como deficiencias
  combinadas en el CIIICI
• No existe simetria el fenotipo de las
  deficiencias en el CI que suelen cursar aisladas
• La mayoría de las deficiencias en el CIII se
  deben a mutaciones en el gen mitocondrial del
  CIII, el gen del cit b

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Línea celular de ratón L929Obtención de la linea
A22
Glu 373 Lys
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• Creación de la línea transmitocondrial FA22
• A22 y FA22 son homoplásmicas para la mutación en
  el cit b

• No se observa actividad enzimática del CIII ni
  del CI

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A22 tiene el mismo fenotipo que las deficiencias
combinadas del CIII CI debidas a mutaciones en
el cit b
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• El complejo III no se forma en A22 ni en FA22
• Los niveles de complejo I en A22 y FA22 están
  seriamente reducidas

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• Existe interdependencia en la formación/estabilid
  ad entre los 2 complejos

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Inhibimos el CIII de forma farmacológica
Después de 2 semanas de tratamiento de de las
células con el inhibidor específico de la
actividad del CIII, el CI no esta afectado
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Es la ausencia física del CIII y no la pérdida de
su actividad lo que produce la pérdida del CI
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Es necesario el CIII para la formación del CI o
solo lo estabiliza?

• En las células control el CI aumenta con el
  tiempo, en cambio en las A22 el CI disminuye a
  medida que pasa el tiempo

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En ausencia del CIII el CI si que se forma, pero
es inestable
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Estudio de la biopsia muscular de un paciente con
mutación en el cit b
Se produce la pérdida concomitante del CIII y
el CI
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La presencia del CIII es requerida para la
estabilidad del CI en células humanas
diferenciadas
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Explicación del fenotipo de pacientes con
mutaciones en el CIII
Pacientes tipo A -
Pacientes tipo B - -

El fenotipo de los pacientes estará modulado por
el grado de heteroplasmia de la mutación
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• La existencia de la asociación entre los dos
  complejos respiratorios, ya documentada, es
  coherente con estos descubrimientos

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ESTUDIO DE LA ARQUITECTURA DE SUPERCOMPLEJOS
MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
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Para la caracterización bioquímica y estructural

• (a), BN-PAGE (poliacrilamida gradiente de
  concentración T El 3-13 ) de mitocondrias de
  corazón bovinas solubilizadas.
• (b), BN-PAGE (T El 3-5 ).
• Ambas tiras de supercomplejos estaban en la
  proximidad cercana en una BN-PAGE (la T El 3-13
  ).

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• La separación fue mejorada en una BN-PAGE con la
  T El 3-5 , BN- PAGE (T El 3-13 ) de los
  supercomplejos aislados I1III2 y I1III2IV1.
• El Supercomplejo I1III2IV1 (BANDA 2) está intacto
  después de la electroelución, pero el
  supercomplejo I1III2 (BANDA 1) muestra dos bandas
  adicionales muy débiles de I y III2.

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Para la actividad enzimática

• La actividad del complejo NADH deshidrogenasa fue
  mostrada por bandas púrpuras que son resultado de
  la precipitación en gel de formazan

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• El la actividad de la citocromo c oxidasa del
  complejo IV fue determinada por la oxidación del
  citocromo c dependiente de 3,3 '-diaminobenzidina
  al óxido marrón e indamina precipitada

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La actividad del complejo I en el supercomplejo
I1III2 y I1III2IV1 así como la actividad del
complejo IV para el supercomplejo I1III2IV1 en
las muestras aisladas fue demostrada
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Ensayos espectofotométricos para evaluar la
actividad de la NADHUBIQUINOL reductasa del
complejo I y la actividad de la citocromo c
reductasa del complejo III en las muestras
electroeluidas. En las condiciones usadas, se
obtuvo
Para concluir ambos supercomplejos aislados
mostraron actividad, pero el supercomplejo
I1III2IV1 era considerablemente más activo.
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Para la microscopía de electrones
I1III2
I1III2IV1

• Las imágenes triangulares están indicadas por
  círculos rojos.
• Las formas L por círculos amarillos.
• Los círculos verdes en (a) indican las partículas
  que podrían ser el complejo dimérico III
  proveniente de la disociación del supercomplejo
  I1III2.
• Las barras de escala representan 100 nm.

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• Las dos vistas representan las dos orientaciones
  preferenciales de los supercomplejos.
• Una orientación es preferida sobre la otra.

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Los mapas de proyección hechos en promedio de los
supercomplejos.

• (a) vistas superiores (espacio intermembrana) del
  supercomplejo I1III2IV1 (con un promedio de 228
  partículas).
• (b) el Supercomplejo I1III2 encabezan la vista el
  promedio de 66 partículas).
• (c) mapa diferencial entre I1III2IV1 y I1III2.
• (d) vista superior del espacio de la matriz de
  I1III2IV1.
• (e) Vista lateral de supercomplejo I1III2IV1
  (promedio de 70 partículas).
• (f) la vista superior del complejo bovino IV a
  través de rayos X, visto desde el espacio
  intermembrana.

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• 300 partículas observada con menos frecuencia que
  las anteriores fueron seleccionadas. Después de
  la alineación y haciendo un promedio, la imagen
  mostró dos salientes grandes sobre un lado de la
  línea brillante, mientras que otra superficie
  apareció lisa.

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• Si comparamos con un mapa de proyección de
  tinción negativa del complejo I en corazón bovino
  (a) se identifica el saliente más grande (e) como
  el brazo de la matriz de complejo I.
• El dominio de la membrana del complejo I en el
  supercomplejo se extiende a lo largo del saliente
  más pequeño en esta vista.
• La línea brillante alrededor del supercomplejo
  puede ser interpretada como los dominios
  transmembrana de la proteína debido al detergente
  y posiblemente la mancha sea debida al azul de
  Coomassie de la BN-PAGE.

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(No Transcript)
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La asimetría de la vista lateral (e) claramente
explica las distintas vistas triangulares (a y
d), que puede ser interpretado como la vista
perpendicular a la membrana del lado de la matriz
y el espacio intermembrana, respectivamente.
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Las disposiciones alternativas de los complejos I
y III2 en supercomplejo I1III2IV1.

• (a) proyección de la estructura del complejo I.
• (b) las vistas laterales de las estructuras de
  rayos X del complejo IV (verde) y (c) el complejo
  III dimérico (rojo) dibujado en la misma escala
  que los mapas de proyección.
• (d) Estructura de rayo X de complejo IV complejo
  (verde) (e) complejo III2 (rojo), ambos vistos
  desde el espacio intermembrana.

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• (f) las estructuras de rayo X de complejo III2 y
  IV superpuesto sobre el mapa de proyección del
  supercomplejo I1III2IV1 (vista lateral).

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• (g) Modelo 1 El complejo III2 y IV superpuesto
  sobre el supercomplejo I1III2IV1 (como mirando
  desde el espacio intermembrana).

contacto con el complejo I y IV, menos contacto
con III2
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• (h) Modelo 2 El complejo III2 está en la parte
  superior del supercomplejo. La masa restante en
  la parte inferior es el brazo de la membrana de
  complejo I. Así el complejo IV comparte una
  superficie de contacto grande con III2, pero hay
  poco contacto con el complejo I.

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Modelo para la estructura del supercomplejo
IIII2 de Arabidopsis thaliana, incorporando la
estructura de rayos X del complejo III y la
densidad de 3D de EM del complejo I del corazón
bovino.

• Vista superior del supercomplejo
• complejo I (amarillo).
• la otra mitad integrada por la membrana inferior
  de complejo III (la estructura que llena espacio)
  visto desde el lado de la matriz.
• Densidad de las proyecciones adicionales del
  complejo I se representan en color naranja.
• El contorno de los dominios hidrófilos de
  complejo III dentro de la matriz son indicadas
  por una línea de puntos verde.

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• Complejo I (amarillo) y complejo III (verde),
  visto a un ángulo de 45 desde el plano de la
  membrana.
• Los componentes de los complejos I y III y de
  la membrana fuera del supercomplejo son indicados
  en azul.

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CONTINUARÁ