MYCOBACTERIA

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MYCOBACTERIA
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Mycobacteria

• Bacilli (2-4 µm), forme filamentose (molto
  sottili fino a 10-15 µm)
• Immobili
• Asporigeni
• Sprovvisti di capsula
• Aerobi obbligati
• Alcool-acido resistenti

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Classificazione
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Struttura cellulare

• Parete cellulare molto spessa
• Componenti della parete peptidoglicano,
  diaminopimelato, polisaccaridi (glucano, mannano,
  arabino-galattano, arabino-mannano)
• Inclusi citoplasmatici (lipidi, glicogeno,
  polimetafosfati)

5
(No Transcript)
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Parete cellulare

• Composizione
• Grosse quantità di glicolipidi
• acido micolico (60)
• complessi lipidi-arabinogalattani
• lipoarabinomannani
• Scarso petidoglicano

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• Gran parte delle proprietà esclusive che
  caratterizzano il genere Mycobacterium sono,
  direttamente o indirettamente, legate alla
  struttura della parete cellulare

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Mycobacterium spp.Parete cellulare

• Funzioni
• Forma e prevenzione lisi osmotica
  (peptidoglicano)
• Inibizione ingresso composti chimici
• Crescita lenta
• Maggiore resistenza agli agenti chimici
• Maggiore resistenza alla fagocitosi
• Induzione sintesi citochine (TNF-?) da parte
  dellacido micolico

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I LIPIDI DELLA PARETE BATTERICA

• GRASSI SOLUBILI IN ACETONE
• CERE
• FOSFATIDI

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CERE

• Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i quali gli
  acidi micolici) ed alcoli.
• La cera D, che in realtà è un glicopeptidolipide,
  è soprattutto nota per le sue proprietà
  adiuvanti essa infatti, se inoculata in
  emulsione idro-oleosa associata ad un antigene
  proteico, potenzia enormemente la risposta immune
  umorale e cellulare del soggetto ricevente verso
  lantigene suddetto.

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ACIDI MICOLICI

• Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più di
  frequente si trovano esterificati nelle molecole
  lipidiche, si tratta di acidi grassi
  ß-idrossilati caratterizzati da una lunga catena
  satura di atomi di C (da 83 a 93)
• A livello della superficie esterna del cell wall
  gli acidi micolici svolgono la funzione di
  recettori fagici.

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FATTORE CORDALE
Un micoside oggetto di studi approfonditi è il
DIMICOLIL-TREALOSO meglio noto col nome di
FATTORE CORDALE, così chiamato perché i
micobatteri tubercolari, privati di tale
sostanza, perdono la caratteristica di
svilupparsi, su certi terreni di coltura, in
fasci serpentiformi.
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FOSFATIDI

• Consistono di glicerolo esterificato con acidi
  grassi (palmitico, oleico) e con acido fosforico
• Sono capaci di evocare da soli una reazione
  cellulare granulomatosa caratteristica e
  sovrapponibile a quella che si osserva
  nellinfezione tubercolare

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CARATTERISTICHE ANTIGENICHE
ANTIGENI
Natura Polisaccaridica (parete cellulare)


Natura proteica (citoplasmatici)
Arabinogalattani Immunogeni solo se inoculati
insieme alle cellule
Responsabili della sensibilizzazione di tipo
allergico
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Mycobacterium tuberculosis
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MECCANISMI DELLAZIONE PATOGENA

• La tubercolosi è unaffezione polmonare e
  pertanto diffonde per via aerea da uomo a uomo
  attraverso i nuclei essiccati delle goccioline di
  saliva emessi con la tosse dei malati di
  tubercolosi
• La prima infezione si traduce in uninfiammazione
  localizzata a carattere essudativo di un limitato
  distretto del parenchima polmonare con
  compromissione dei linfonodi mediastinici
  (COMPLESSO PRIMARIO)

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Mycobacterium tuberculosisin lung
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MECCANISMI DELLAZIONE PATOGENA

• Al complesso primario segue uno STATO ALLERGICO
  evidenziabile mediante iniezione di TUBERCOLINA
  che generalmente dura tutta la vita
• In seguito ad una reinfezione o riattivazione del
  complesso primario, linfezione può compromettere
  il parenchima polmonare e diffondere a qualsiasi
  organo

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DIAGNOSI DI LABORATORIO

• ESAME MICROSCOPICO
• ESAME COLTURALE
• IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
• TIPIZZAZIONE FAGICA
• ANTIBIOGRAMMA

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ESAME MICROSCOPICO

• FLUORESCENZA
• COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen

21
FLUORESCENZA
400x
22
ESAME MICROSCOPICO COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen
Lesame microscopio assume, per la ricerca dei
micobatteri, una rilevanza diagnostica che non
trova riscontro in altri settori della
batteriologia, e ciò grazie alla
peculiare proprietà di tali microorganismi di
essere alcool-acido resistenti. La natura della
alcool-acido resistenza non è ancora del tutto
chiarita, essa sembra comunque correlata
alla componente lipidica della parete cellulare
gli acidi micolici si complesserebbero
infatti con la fucsina impedendone il rilascio
nonostante il trattamento con alcool ed acido
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Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)

• Step 1
• Versare la fucsina basica
• Step 2
• Fare evaporare scaldando il colorante
• alla fiamma per 5 min
• Lavare con acqua

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Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)

• Step 3
• Decolorare con alcool-acido fino alla
• scomparsa del colorante (circa 2 min)
• Lavare con acqua
• Step 4
• Contrastare con blu di metilene per
• 1-2 min
• Lavare con acqua

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Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione
microscopica

• Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono
  colorati in rosso
• Gli organismi non acido-resistenti risulteranno
  colorati in blu

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Ziehl-Neelsen
1000x
27
ESAME COLTURALE

• Lesame colturale per micobatteri presenta delle
  peculiarità, estranee alla batteriologia comune,
  legate alla lentezza con cui tali germi crescono
  sui terreni di coltura.
• Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra
  i micobatteri e leventuale flora associata è
  infatti tale che la presenza di questultima, sia
  pur costituita da specie non particolarmente
  invasive ed a carica microbica ridotta, finisce
  regolarmente con lo sfruttare completamente tutta
  la superficie di terreno a disposizione ben prima
  che le colonie dei micobatteri, ivi comprese
  anche le specie a crescita più rapida, possano
  raggiungere dimensioni tali da poter essere
  apprezzate.
• La coltivazione dei micobatteri è possibile solo
  a condizione che questi si trovino in coltura
  pura (eventualità limitata in pratica solo a
  materiali particolari quali liquor, liquidi
  cavitari, sangue) o che a tale condizione possano
  essere ricondotti artificialmente
  (decontaminazione).

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LA DECONTAMINAZIONEIl decontaminante ideale è
una sostanza dotata di attività antibatterica su
tutta la flora associata e del tutto priva di
attività nei confronti dei micobatteri. a)
NaOH al 4. Può essere considerato il capostipite
dei procedimenti di decontaminazione (svolge
anche azione fluidificante) ormai non più usato
a causa dellelevata lesività sui micobatteri.b)
H2SO4 al 4. E eccessivamente lesivo per i
micobatteri.c) Acido ossalico al 5. Il suo
impiego è giustificato solo per materiali
fortemente contaminati da Pseudomonas aeruginosa
essendo assai lesivo per i micobatteri.d)
Fosfato trisodico al 25 cloruro di benzalconio
allo 0,3. Decontamina e fluidifica al tempo
stesso, la lesività sui micobatteri è ridotta e
le contaminazioni risultano contenute.f) Fosfato
trisodico allo 0,03 NaOH allo 0,05 di
isobutil-naftalina-sulfonato allo 0,03.
Lattività decontaminante è molto buona, media la
lesività sui micobatteri.
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CARATTERISTICHE COLTURALI

• velocità di crescita
• aspetto delle colonie
• rugose lisce
• fotocromogene
• scotocromogene
• non pigmentate
• crescita a varie temperature
• test di inibizione selettiva

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TERRENI SELETTIVI
Terreni Componenti Sostanze inibitrici
Lowenstein-Jensen Uova coagulate, Sali, glicerolo, fecola di patate Verde malachite, cicloesimide, lincomicina, acido nalidixico
Middlebrook 7H10 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo Verde malachite, cicloesimide, lincomicina, acido nalidixico
Terreno 7H11 Sali, vitamine, cofattori, acido oleico, albumina, catalasi, glicerolo, idrolizzato di caseina Carbenicillina, amfotericina B, polimixina B
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Caratteristiche colturali
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Caratteristiche delle colonie osservate con un
microscopio da dissezione
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METODI COLTURALI ALTERNATIVI

• metodo radiometrico
• terreno bifasico
• terreno con indicatore fluorescente
• terreno Redox

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METODO RADIOMETRICO

• flaconcini sigillati di terreno liquido
  contenente un substrato (ac. palmitico) marcato
  con 14C
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del
  metabolismo batterico
• rilevamento di radioattività nella fase gassosa
  come spia di batteri metabolicamente attivi

notevole accorciamento dei tempi di crescita
maggior
sensibilità
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METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI
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TERRENO BIFASICO

• flacone di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo,
  agarizzato, agar cioccolato)
• arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie
  isolate sul terreno solido

moderato accorciamento dei tempi di crescita
maggior
sensibilità
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TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE

• provetta di terreno liquido per micobatteri
• miscela di antibiotici (PANTA) per il
  contenimento delle contaminazioni
• fluorocromo, incorporato in un film di silicone
  sul fondo della provetta, sensibile alle
  variazioni del contenuto di ossigeno
• comparsa di fluorescenza per effetto del consumo
  di ossigeno operato dal metabolismo batterico
• rilevamento della fluorescenza
• visivo, sotto una lampada UV
• automatizzato

accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
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TERRENO REDOX

• i micobatteri crescono nel terreno liquido di
  Kirchner formando piccoli fiocchi o
  intorbidamento uniforme
• i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono
  ridotti a formazano dai micobatteri in crescita
• il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si
  fissa alla superficie delle colonie
  micobatteriche permettendone il riconoscimento

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IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

• accumulo di niacina
• riduzione dei nitrati
• catalasi
• quantitativa
• termoresistente
• idrolisi del Tween 80
• ureasi
• arilsolfatasi
• riduzione del tellurito

40
(No Transcript)
41
ANTIBIOGRAMMA

• i farmaci antitubercolari maggiori
• il principio del metodo delle proporzioni
• lantibiogramma manuale
• lantibiogramma automatizzato
• lantibiogramma sui micobatteri non tubercolari

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ANTIBIOGRAMMA

• LAntibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in
  capsule di Petri a quadranti contenenti agar 7H11
• Un quadrante è usato come controllo, mentre
  ciascuno degli altri quadranti contiene un
  farmaco antimicrobico diverso
• Tutti i quadranti vengono inoculati con una
  concentrazione standardizzata del microrganismo
  in esame
• La sensibilità a ciascun farmaco è determinata
  paragonando il numero delle colonie cresciute nei
  quadranti contenenti i farmaci con il controllo
  (se la percentuale di resistenza è superiore
  all1 il ceppo viene considerato resistente al
  farmaco)

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ANTIBIOGRAMMA
Antibiotico incorporato in dischetti di carta
Antibiotico incorporato nellagar
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La diagnostica tradizionale

• Esame microscopico
• test rapido ma scarsamente sensibile
• Esame colturale
• sensibile ma richiede da una a otto settimane
  problema delle contaminazioni
• Identificazione
• test biochimico-colturali scarsa specificità,
  tempi lunghi
• Antibiogramma
• diretto relativamente rapido ma con alta
  incidenza di contaminazioni
• da ceppo isolato tempi lunghi

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Metodi di identificazione alternativi

• DNA probe
• HPLC degli acidi micolici
• sequenziamento genico
• 16S rDNA
• SOD
• HSP65

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DNA-probe, alternativa allidentificazione?

• Vantaggi
• enorme risparmio di tempo
• specificità pressoché assoluta
• Svantaggi
• disponibili per un numero limitato di specie
• costo
• complessità di esecuzione?

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IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE
DNA-probes marcate con 125I
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HPLC degli acidi micolici

• acidi grassi, ramificati in posizione ?
• presenti nella parete batterica dei generi
• Corynebacterium 22-38 atomi di C
• Rhodococcus 34-52 atomi di C
• Nocardia 44-60 atomi di C
• Gordona 48-66 atomi di C
• Tsukamurella 64-78 atomi di C
• Mycobacterium 60-90 atomi di C
• presenza di numerosi gruppi funzionali che
  differenziano 7 tipi di acidi micolici
  micobatterici
• alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere,
  omega' metossi-

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HPLC degli acidi micolici

• saponificazione, estrazione e derivatizzazione
  degli acidi micolici presenti nella parete dei
  micobatteri
• frazionamento mediante HPLC
• individuazione dei picchi presenti nel tracciato
  cromatografico e identificazione per confronto
  con profili di riferimento

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profilo HPLC del M. tuberculosis complex
ad eccezione del M. bovis BCG
SI
51
esempi di profili HPLC
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Il sequenziamento genico

• E la tecnica di riferimento per
  lidentificazione
• Possibili bersagli
• rRNA o rRNA 16S
• gene codificante per le heat shock proteins
• gene codificante per la superossido dismutasi
• spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S

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Amplificazione genica alternativa allesame
microscopico?

• Vantaggi
• sensibilità superiore (ma non di molto)
• specificità di specie (ed eventualmente anche di
  genere)
• Svantaggi
• esecuzione complessa
• costo elevato

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Amplificazione genica alternativa allesame
colturale?

• Vantaggi
• molto più rapida
• se positiva rende superflua lidentificazione
• eseguibile anche su campioni pesantemente
  contaminati
• Svantaggi
• non altrettanto sensibile
• non rileva i micobatteri appartenenti ad altre
  specie
• false negatività dovute agli inibitori
• false positività dovute a contaminazioni
• costo elevato
• esecuzione complessa
• impossibilità di eseguire lantibiogramma

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Target dellamplificazionedel M. tuberculosis
complex

• Geni presenti in copia singola
• gene codificante per lantigene di 65-kD (HSP)
• Brisson-Noel et al. Lancet 1989
• gene codificante per lantigene di 126-kD (fusion
  protein)
• Hermans et al. J.C.M. 1990
• gene codificante per lo rRNA 16S
• Boddinghaus et al. J.C.M. 1990
• gene codificante per lantigene di 38-kD
  (proteina b)
• Miyazaki et al. J.C.M. 1993
• Sequenze ripetute
• IS6110
• Eisenach et al. J.I.D. 1990

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Raccomandazioni sullimpiego del test di
amplificazione

• Non sostituisce esame microscopico e colturale
• Da eseguirsi solo su campioni selezionati
• Lattendibilità del test sui materiali non
  respiratori non è dimostrata
• Non utilizzabile per il monitoraggio della
  terapia
• INTERPRETAZIONE
• Amplificazione / Microscopico probabile TBC
• Amplificazione - / Microscopico
• ripetizione su altri 2 campioni, se il risultato
  viene confermato infezione da MOTT o
  presenza di inibitori
• Amplificazione / Microscopico -
• ripetizione su uno o 2 campioni, se il risultato
  viene confermato probabile TBC

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Conclusioni

• AMPLIFICAZIONE? SI, ma .
• solo in centri qualificati
• solo su campioni selezionati
• non per il monitoraggio della terapia
• La sensibilità dei sistemi commerciali deve
  essere aumentata (ovviamente non a scapito della
  specificità)
• Le tecniche in house non sono adatte allimpiego
  in routine

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Epidemiologia molecolare

• Sorveglianza della tubercolosi e tracciamento di
  ceppi particolari (Beijing)
• Riconoscimento delle infezioni miste
• Distinzione di recidive e reinfezioni
• Individuazione delle contaminazioni di
  laboratorio

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Principali tecniche per lepidemiologia molecolare

• PFGE
• frammentazione del genoma mediante enzimi di
  restrizione specifici per siti poco frequenti
• PCR random
• usa primer scelti in maniera casuale
• RFLP
• applicabile a specie di cui si conoscono
  insertion sequence

60
RFLP

• BERSAGLIO il transposone IS1610, di cui possono
  essere mediamente presenti nel M. tuberculosis
  complex da 6 a 17 copie, variamente dislocate nel
  genoma
• PRINCIPIO un enzima di restrizione, specifico
  per un sito presente allinterno del IS1610,
  spezzetta il genoma in un numero di frammenti non
  inferiore al numero di IS presenti. I frammenti
  presentano dimensioni diverse a seconda della
  posizione dei singoli IS nel genoma
• RIVELAZIONE mediante elettroforesi si ottengono
  pattern che differiscono per il numero e la
  posizione delle bande
• La possibilità che ceppi diversi abbiano pattern
  uguali sono trascurabili, la stabilità dei
  pattern è elevata

61
RFLP fingerprinting