Elozm

1
Elozmények
Peptidkémia
Protein kémia
Analitikai kémia
1923 F. Pregl Mikroanalitika
1901 E.Fischer Gly-Gly
1952 Stein and Moore Aminosav analizis
1932 Bergman és Zervas Benziloxi-karbonil
csoport
1954 P. Edman Protein szekvenálás
Kromatográfia
Elektroforézis

• F. Sanger
• Az inzulin priemr szerkezete

• B. Merrifield
• Szilárd fázisú peptid szintézis

Röntgen (X-ray) krisztallográfia

• Á. Furka
• Kombinatorkus peptid szintézis

NMR

1. M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin
   térszerkezete

Tömeg spektroszkópia
2
A peptid kötés amid kötés (E.Fischer, 1902)
amid
poliamid
Emil Fischer
John B. Fenn
3
A peptid kötés amid kötés (E.Fischer, 1902)
N-terminális
C-terminális
Dipeptid 2 Oligopeptid
2-15 Polypeptid gt15
4
Kötéstípusok a fehérjékben
Kovalens
Amid
- CO NH -
Diszulfid
- S S -
Nem kovalens
Hidrofób, Van der Waals
H-híd (inter és intra)
ionos
5
Fehérjék szerkezetének meghatározása

• Tisztítás homogén minta eloállítása
• Aminosavsorrend (primer szerkezet) meghatározása
• - aminosavösszetétel
• - aminosavsorrend
• - N-terminális aminosav
• - C-terminális aminosav
• 3. Térszerkezet (3D) meghatározása
• - szekunder (másodlagos)
• - tercier (szupermásodlagos)
• - quaterner

6
Fehérje izolálás gélelektroforézis (egy- és
kétdimenziós)
Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200 mg protein,
3,5 x 0,8 cm
Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 mg, 14C
jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm,
exp. 825 h
7
Gélelektroforézis
8
Egydimenziós gélelektroforézis
HeLa sejtmag fehérjék
Swiss-Prot
9
Kétdimenziós gélelektroforézis (HeLa sejtmag
fehérjék)
Mw
pI
10
Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása
a) Amino csoport kimutatás
c) Lowry-Hartree Reagens biuret 3
H2OxP2O5x13 WO2x5 MoO3 10 H2O, Folin-Ciocalteu-fen
ol
b) Biuret próba Reagens CuSO4/NaOH
l 540-550 nm
l 720-750 nm
d) BCA (bicinoninic acid, Reagens biuret BCA
l 562 nm
e) Bradford reagens (trifenil-metion)
l 595 nm
11
Primer szerkezet meghatározása
1. Diszulfid-híd felbontása
12
2. Aminosav összetétel meghatározása
2.1. Hidrolizis
O
O
H2O / 6M HCl
C
NH2-CH2-
C
NH2-CH2-

NH-CH-COOH
105 oC
OH
NH-CH-COOH
CH3
glicin
Gly-Ala
alanin
CH3
2.2. Elválasztás és származék- képzés
Ioncserés kromatográfia, Rockefeller Intézet,
1950 Gyanta vízben nem oldódó polimer SO3-
csoportokkal Detektálás ninhidrin reakció , l
570 nm
13
2.3. Származékképzés és elválasztás
Származékképzés o-ftálaldehid ElválasztásHPLC,
Detektálás lg 360 nm le 455 nm
Hunkapiller et al. Science, 1984
14
2.4. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására



1-fluor-2,4-dinitrofenil- 5-L-Ala-amid (FDAA)
(D,L)
pH 9,0 10 perc




D,L-származék
L,L-származék
HPLC elválasztás
15
3. Aminosav sorrend meghatározása
3.1. N-terminális
3.1.1. Sanger reakció, 1958, inzulin
NO
2
2
NaHCO3
N
H
C
H
CO -

C
H
CO -
N
H
2
4
HF
R
R
O
N
2
1-fluor-2,4-dinitro benzol
6 M HCl
aminosavak
2,4-dinitrofenil aminosav
2,4-dinitrofenil fehérje
l254 nm
16
3.1.2. 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonil
kloridl(Dansyl-klorid, Hartley, 1963)

NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH
bázispH 7,5-8,0
HCl
6 M HCl hidrolizis
l g360 nm l e480 nm
(Dansyl-aminosav)
17
3.2. C-terminális
NH2-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH
H2N - NH2

sav, 90o C 20 -100 óra
NH3-L CO -NH-NH2, NH3-K-CO-NH-NH2.....NH3-L-
COO-

• 3.3. Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950)
• lépés Reakció fenilizotiocianáttal (addició)
• lépés Hidrolizis
• lépés A feniltiohidantoin származék azonosítása

18

1. lépés Reakció fenilizotiocianáttal

pH 8-9, 40 oC
S II
feniltiocarbamil származék
2. lépés Hidrolizis (H/TFA)
anilinotiozolinon származék
fenilhidantoin (PTH) aminosav
19
3. lépés A feniltiohidantoin származék
azonosítása
20
4. Fehérjék feldarabolása
4. 1. Kémiai hasítás 4.1.1. Reakció brómciánnal
(BrCN), Met -
H2O, H
NH2-CH-COOH (CH2)2 OH
homoszerin
21
4.1.2. Reakció hidroxilaminnal (NH2 - OH) Asp
- Gly
4.1.2. Reakció 2-nitro-5-tiociano - benzoesav
- Cys
O2N
HOOC
4. 2. Enzimatikus hasítás

• Terminológia (Schechter, Berger)
• S4 S3 S2 S1 S1 S2 - S3 S4 enzim
• P4 P3 P2 P1 P1 P2 - P3 P4
  szubsztrát
• - P4 P3 P2 P1 OH H- P1 P2 - P3
  P4

Szerin proteázok tripszin (Arg, Lys) P1,
trombin, kimotripszin (Tyr, Trp,
Phe) P1, elasztáz,
kallikrein.. Cisztein proteáz papain,
actinidin... Karboxil proteáz pepszin,
katepszin D (lizoszoma), LysC
(Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz
AspN (Asp)P1..... Metalloproteáz temolizin,
karboxipeptidáz A...
22
Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés
23
Térszerkezet
24
Szerkezeti hierarchia
25
Az amid kötés
Delokalizáció, 2 e, 3 atom

• Gyenge N bázis
• Eros H-híd
• Részleges kettos kötés
• Síkalkat
• Cisz/transz izoméria

Nomenklatúra
26
A Ramachandran térkép - bevezetés
27
A Ramachandran térkép
28
Másodlagos szerkezet típusai
29
Helikális szerkezet
310 hélix, alfa-hélix,
pi-hélix
30
Béta redozott réteg szerkezet
31
Kanyar szerkezet
32
A Ramachandran térkép - összefoglalás
33
(No Transcript)
34
Konformerek energiatartalma
Források kötéshossz (Ed) változatlan
vegyértékszög (Eo) változatlan
torziós szög (Ew) - változik
Nem kötött atomok távolsága (Ew) Köto
elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztati
kus kölcsönhatás (Er)
DE DEd DEo DEw DEw DEh DEe

• Példa
• Fehérje 100 aminosavból
• ha
• 10 konformáció/as
• lehetséges
• akkor
• 10100 konformer

b) ha 2 konformáció/as lehetséges akkor 1030
konformer
35
Szupermásodlagos szerkezetek
Görög kulcs
Béta kigyó
Csoportosítás Alfa (a) csak alfa hélix Béta
(b) csak béta réteg Alfa béta ( a b) hélix
és réteg egymástól távol Alfa/béta (a/b) hélix
és réteg egymással kölcsönhatásban
36
Negyedleges szerkezet - a kollagén
37
A protemika alapjai
38
A médium összetételének hatása az E-coli
fehérjeösszetételére
Arg
- Arg
Farrell PHO (1978)
39
Fehérje bioszintézise
40
Nem fehérje alkotó természetes aminosavak
A)
N
H
C
H
COOH
N
H
C
H
2
2
2
C
H
2
C
H
- CO2 Glu dekarboxiláz
2
g-aminovajsav (GABA)
C
H
C
H
2
2
HOOC
HOOC
Glu
C
H
3

• Karnitin
• Zsiranyagcsere
• Mitokondrium transzport
• Sejtpermeabilitás

N
C
H
C
H
2
3
C-vitamin (máj)
Lys/Met
C
H
O
H
C
H
3
C
H
2
HOOC
B)
b
a
b-Alanin
C
H
3
C
H
C
C
H
O
H
CO
N
H
C
H
C
H
2
COOH
2
2
O
H
C
H
3
Pantoténsav
41
C)
N
H
C
H
COOH
N
H
C
H
2
2
2
1. CO2 2. oxidáció
C
H
C
H
2
2
S
H
SO
H
3
(máj, B6)
cisztein
taurin
D)
N
H
C
H
COOH
2
N
H
C
H
COOH
2
argináz H2O

(CH
)
2
3
(CH
)
2
3
N
H
C
N
H
2
2
N
H
C
N
H
2
N
H
2
O
karbamid (urea)
N
H
ornitin
arginin
NH3, CO2
N
H
C
H
COOH
2
(CH
)
2
3

• urea ciklus (máj)
• hagyma, fokhagyma
• detoxifikáció

N
H
C
N
H
2
O
citrulin (citrullus lat görögdinye)
42
E)
C
H
3
N
H
C
H
COOH
2
szarkozin (izom)
H2N-CN
C
H
3
N
C
H
COOH
N
H
C
2
2
N
H
kreatin . H2O (N-metil-guanidino-ecetsav)

• op 303 oC
• izom
• H2PO4-NH - (kreatin-foszfát)