Diapositive 1

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(No Transcript)
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Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella
bronchiseptica
Bordetella beta- protéobactérie bronchiseptica
Coccobacille gram négatif, mobile aérobie S
et N tractus respiratoire présent chez de
nombreux mammifères responsable de
bronchopneumonie chez les animaux zoonose
possible parent de B. pertussis et B.
parapertussis génome séquencé
(5.3Mbase) Bordetella ssp. facteurs de virulence
(adhesines et toxine) exprimées sous le contrôle
dun système à 2 composants (BvgAS
system) nécessité dun TTSS pour induire la
cytotoxicité, la colonisation à long terme de
la trachée
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Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella
bronchiseptica
BvgAS système BvgS protéine membranaire
histidine kinase senseur du milieu
extracellulaire activée , phosphoryle
BvgA BvgA facteur de transcription pour les
gènes de virulence régulation du TTSS
Système de sécrétion de type 3 très conservé
chez les bactéries Gram- un des mécanismes très
impliqué dans la virulence translocation des
effecteurs du cytosol de la bactérie dans le
cytoplasme de la cellule hôte selon le stade
de linfection, les effecteurs peuvent variés
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Représentation dun TTSS
Protéines sécrétées via le TTSS 4 protéines
identifiées chez Bordetella. BopB, BopD, BopN et
Bsp22 BopB/D complexe de perforation de la
membrane plasmique BopN ATPase permettant la
sécrétion
Objetif de létude Identifier de nouveaux
effecteurs de Bordetella passant via le TTSS
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Recherche de protéines sécrétées via le TTSS

• -Comparaison des profils protéiques des
  surnageants
• de culture des souches wt et ?TTSS en SDS-PAGE
• 10 bandes différentes entre les 2 pistes dont
• BopB, BopN, BopD, Bsp 22

-Extraction du gel des 6 bandes non
identifiées -Trypsination et analyse par
spectromètre de masse pour identification des
protéines MALDI-TOF MS ou ESI-MS/MS -génération
in silico dune banque de peptides à partir du
génome
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Recherche de protéines sécrétées via le TTSS

• -Analyse des séquences peptidiques
• 3 bandes sont des produits de dégradation de
  Bsp22 et BopD
• Bande a 1 peptide résidus 33-44 de HP p69
• Bande b 5 peptides

• Une seule protéine a été identifié à lissue du
  screening.
• HP de 69 kDa renommée BopC

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Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent
elles à une seule protéine BopC?
Génération dun mutant ?BopC Clonage puis
délétion du gène bopC via le système
Gateway Introduction dans un plasmide suicide
conjugatif (pRK6) Complémentation du mutant
?BopC par le plasmide pBopC Clonage dune
cassette promoteur fha- bopC- terminateur
rrnB1 fha hémagglutinine filamenteuse de
Bordetella activé par BvgA Introduction dans un
plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)
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Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent
elles à une seule protéine BopC?
Comparaison des profils de sécrétion
formation de complexe multimérique sécrétion
dépendante dun TTSS
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BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche dun effet cytotoxique de
BopC Infection de cellules L2 de rat pendant 20
min Coloration avec une solution de Giemsa
(différenciation nucléaire et cytoplasmique)
95 des cellules infectées par les témoins
sont détruites Pas de cellules dégradées pour
les mutants ?bopC et ?TTSS
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BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche dun effet cytotoxique de
BopC Infection de cellules HeLa Evaluation de
la cytotoxicité par mesure de la LDH
La cytotoxité de B. brochiseptica est associée à
bopC.
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BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche dun effet cytotoxique de
BopC Infection de cellules HeLa pendant
1h Evaluation de la mortalité par coloration au
bleu trypan
57
48
12
BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Données bibliographiques B. brochiseptica
induit une nécrose des cellules sans activation
des caspases Cependant, observation de certaines
cellules infectées TUNEL (terminal
deoxynucleotidyl transferase- mediated
dUTP-biotin nick end-labelling) Coloration
différentielle de la mort cellulaire Cellules
apoptotiques coloration dense au niveau du
noyau Cellules non apoptotiques coloration
diffuse du noyau
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BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Evaluation de la mort cellulaire Observation des
cellules HeLa infectées à 2h (ou 5h pour la
stauroporine)
BopC est requis pour linduction de la mort
cellulaire, mais ninduit pas dapoptose.
Stsp staurosporine, inhibiteur des PK
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BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
BopC est-elle une protéine formant un pore du
TTSS? Mesure de lactivité hémolytique (30min
de contact)
Contrairement à BopB/D, BopC nappartient pas au
complexe de perforation de la membrane plasmique
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BopC et phosphorilation
Données bibliographiques B. brochiseptica
induit des déphosphorylations dans des cellules
L2 infectées. Ce phénomène est TTSS dépendant.
Recherche dun effet de BopC sur les protéines
tyrosine phosphorylées (PY). Observation par
immunofluorescence de différents
facteurs adhérence bactérienne ( actine et
bactérie) Etat de phosphorylation des PY
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BopC et phosphorilation
Observation des cellules HeLA après 0, 20 min ou
1h dinfection
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BopC et phosphorilation

• Au cours du développement de linfection
• ladhésion et la colonisation des cellules ne
  sont pas modifiées
• chez les mutants ?bopC et ?TTSS.
• létat de phosphorylation des PY est modifié par
  la souche wt
• mais ni par le mutant ?bopC, ni par le
  mutant ?TTSS

BopC induit une déphosphorylation des PY dans les
cellules infectées.
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BopC et phosphorilation

• Au cours du développement de linfection B.
  brochiseptica BopC
• requis pour linduction de la mort cellulaire
• modifie létat de phosphorylation des PY

Sur quel aspect BopC agit principalement? Infect
ion de cellules HeLa en présence dinhibiteur de
la déphosphorylation, le sodium
orthovanadate Observation en microscopie à
fluorescence Mesure de la cytotoxicité (LDH et
TUNEL)
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BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica
wt en présence ou non de vanadate
Létat de déphosphorylation des PY dans les
cellules en présence de vanadate est relativement
atténué.
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BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica
en présence ou non de vanadate
La présence de vanadate atténue la
déphosphorylation des PY induite par BopC.
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BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica
en présence ou non de vanadate
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BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica
en présence ou non de vanadate
Le vanadate et donc létat de déphosphorylation
des PY nont pas deffet sur la cytotoxité
cellulaire.
?PY dans les cellules infectées par B.
brochiseptica a lieu après la mort cellulaire
dépendante de BopC.
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BopC et sécrétion via le TTSS
Données bibliographiques Les effecteurs TTSS
dépendants sont introduits directement dans la
cellule hôte depuis le cytoplasme bactérien via
le TTSS. BopC est-elle un effecteur de type
III? Utilisation dun système rapporteur TEM-1
ß-lactamase ( Charpentier et Oswald, 2004)
Fluorescence Resonance Energy Transfert
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BopC et sécrétion via le TTSS
Génération des fusions TEM1 Amplification PCR
des gènes bopC, bcrH2 (protéine cytoplasmique
induit par BvgA) et map (effecteur de
EPEC) Clonage dans le pCX340 (fusion
traductionnelle avec TEM1) puis PCR pour
introduction dans un plasmide réplicatif
conjugatif (pRK415) via le système Gateway,
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BopC et sécrétion via le TTSS
Analyse des transformants ?bopC et ?bopB et ?TTSS
avec les plasmides TEM1
Protéines totales
Protéines sécrétées
5
20
Les produits de fusion BopC-TEM1 sont
correctement synthétisés et sécrétés exceptés
dans la souche ?TTSS.
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BopC et sécrétion via le TTSS
Cellules HeLa infectées CCF2-AM
70 FRET
BopC est transloquée via le TTSS dans la cellule
hôte. Le signal dadressage se situe dans les 48
premiers acides aminés N-ter.
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BopC et cytotoxicité dans la cellule hôte
BopC a un effet cytotoxique mais est-il direct ou
résulte t- il dune cascade de
régulation? Clonage de BopC dans un plasmide
dexpression eucaryote Transfection des cellules
COS-7, HeLa, 293T Mesure de la cytotoxicité à 18h
Lexpression de BopC directement dans la cellule
permet dinduire la mort cellulaire sans
intervention dautres facteurs de virulence.
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Discussion
BopC (Bordetella outer protein involved in
cytotoxicity) protéine de 69kDa impliquée dans
la mort cellulaire protéines sécrétées via le
TTSS pore forming proteins (translocators)
(1) ou effecteurs (translocated protéins)
(2) effecteur de cytotoxicité qui provoque la
nécrose des cellules infectées.
Analyse in silico du gène bopC BopC a une
fonction protein-tyrosine phosphatase (PTPase)
comme YopH mais rBopC activité PTPase membre
de la famille PTPase activité catalytique sur la
cystéine 403 dans YopH BopC na pas de
cystéine Leffet PTPase ne serait pas lié à BopC
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Discussion

• Analyse in silico du gène bopC
• Recherche de protéines homologues et ou de motifs
  conservés
• Présent uniquement chez les souches de
  Bordetella (identité gt95)
• Localisation à lextérieur du locus TTSS
• idem pour dautres effecteurs de TTSS (SopE,
  SigD, orf3,Nle5)
• Recherche dîlots de pathogénie dans une région
  de 20kb flanquant bopC
• transposase 5kb en amont de bopC
  B.parapertussis
• transposase 2kb en amont et intégrase 1.6kb
  en aval de bopC B. pertussis
• Rien chez B. bronchiseptica
• Régulation de bopC par le système BvgAS

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Discussion

• La protéine BopC
• BopC est sécrétée sous forme de multimère ou
  compléxée (150-200kDa gt69kDa)
• observation en SDS-PAGE de tels phénomènes
• pour des protéines ayant de nombreux segments TM
  
• mais BopC possède un seul TM prédit (619-643aa)
• la multimérisation de BopC serait porté par la
  partie Cter (449-658 aa) de BopC
• BopC et TTSS
• Les TTSS peuvent sécréter des effecteurs
  hétérologues
• Xanthomonas TTSS reconnaît YopE
• Yersinia TTSS reconnaît Pseudomonas AvrB et
  AvrPto
• Bordetella TTSS reconnaît EPEC Map bien que moins
  stable ( absence de la chaperone CesT)
• BopC aurait un effet régulateur sur lexpression
  des autres protéines du TTSS

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(No Transcript)
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La spectrophotométrie de masse
MALDI-TOF Matrix assisted laser
desorption/ionization Time of Fly ESI
Electrospray Ionization
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Phage lambda recombination in E. coli
cos
The Gateway System relies on five sets of
specific and non cross-reacting att sequences
l
Phage
attP
232 bp
x
attB
E. coli
21 bp
The specificity is given by the 7 nucleotides of
the core region
Integration (Int, IHF)
Excision (Int, IHF, Xis)
attL
attR
Lysogen
96 bp
157 bp
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Glossary of terms used in Gateway cloning
att site A defined length of DNA that
constitutes a recombination site. There are 4
classes of att sites called attB, attP, attL, and
attR. ccdB gene A counterselectable gene that
allows for negative selection of unwanted
by-product plasmids after recombination. Donor
(pDONR) Vector A vector with attP sites
flanking a counterselectable gene that recombines
with a gene of interest flanked by attB
sites. BP reaction A recombination event
between attB and attP sites catalyzed by BP
Clonase II Entry (pENTR) clone A vector that
contains your gene of interest flanked by attL or
attR sites. LR reaction A recombination event
between attL and attR sites catalyzed by LR
Clonase II Destination (DEST) Vector An
application-geared vector with attR sites
flanking a counterselectable gene that will
recombine with one or more entry
clones. MultiSite Gateway Technology A system
that allows simultaneous assembly of multiple DNA
fragments into a single destination vector
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Building a Gateway Entry Clone


BP Clonase II
Obtaining a Gateway Expression Clone
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  CTGCTTTTTTGTACAAACTTG attB1   CAGCTTTCTTGTACA
AAGTTG attB2   CAACTTTATTATACAAAGTTG
attB3   CAACTTTTCTATACAAAGTTG
attB4   CAACTTTTGTATACAAAGTTG attB5
Standard Gateway
MultiSite Gateway
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2-fragment MultiSite Gateway Pro
PCR Fragments
attB2
attB5
attB5r
attB1
X
X
X
X
pDONRs
attP2
attP5
attP5r
attP1
BP reactions
attL5
attL2
Entry Clones
X
attL1
attR5
X
Destination Vectors
attR2
attR1
LR reaction
Expression clones
attB2
attB5
attB1
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MultiSite Gateway Three-Fragment Vector
Construction Kit
BP reactions
attR1
attL4
attL3
attR2
Entry clones
X
X
attL2
attL1
Destination vector
CmR
attR3
attR4
ccdB
LR reaction
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Système TEM