Citologie si Histologie Practica

1
Citologie si Histologie Practica

• Curs 2

2
Diagnosticul citologic

• Simplu, ieftin, repetabil.
• Scop principal leziunea este sau nu maligna.
• Studiul citologiei exfoliative la mijlocul
  secolului XIX
• În 1843 Walshe face referire la mici fragmente
  expectorate cu caracter malign (tumori de tract
  respirator).
• În 1847 Pouchet face primele referiri asupra
  citologiei vaginale normale.
• În 1860 Beale face primele referiri asupra
  celulelor descuamate în context diagnostic (sputa
  la o tumora faringiana).
• 1864 Sanders citologia urinara la pacientii cu
  tumori vezicale.
• 1927 Babes arata pentru prima oara ca este o
  metoda utila pentru diagnosticul cancerului de
  col uterin înainte de invazie (articol publicat).
• 1928 Papanicolaou publica un articol pe aceeasi
  tema.
• 1940 intra în atentia lumii medicale ajutat de
  Charles Cameron (directorul medical si stiintific
  al Societatii Americane de Cancer) care
  popularizeaza testul PAP.

Aurel Babes
3
Raportul citologic - principii

• Foarte importanta tehnica efectuarii frotiurilor
• Fara descriere macroscopica.
• Sunt importante datele clinice primite de la
  clinician.
• Citodiagnosticul se refera la caracterul malign
  sau benign al celulelor.
• Nu face referiri asupra formei histopatologice de
  tumora.
• Nu face referiri legate de stadiu si gradul
  tumoral (G)
• Citodiagnosticul negativ nu infirma existenta
  tumorii.
• Nu aduce informatii prognostice si terapeutice.
• Citologia nu substituie examenul histopatologic.
• Metode speciale de coloratie ?

4
Principiile de baza ale interpretarii si
raportarii citologiilor

• Diagnosticul citologic este considerat atât
  stiinta cât si arta.
• Este adeseori mai dificil decât diagnosticul
  histopatologic.
• Diagnosticul citologic are la baza o sinteza a
  întregului ansamblu si nu doar modificari ale
  celulelor individuale.
• Datele clinice sunt indispensabile.
• Uniformitatea metodelor tehnice din fiecare
  laborator.
• Diagnosticul citologic se bazeaza adesea pe
  modificari minore (nucleare si/sau
  citoplasmatice).
• Sistemul de raportare (sistemul Bethesda) are
  valoare din punct de vedere epidemiologic si în
  cercetare, dar uneori priveaza patologul de
  flexibilitate în diagnostic.
• Este foarte importanta cunoasterea caracterelor
  celulare normale

5
Istoric

• Georgios Nicolas Papanicolaou (1883-1962)
• Kymi (Grecia)
• 1898 Universitatea din Atena
• 1904-1906 asistent medical în armata
• Începe cariera medicala bolnavii de lepra
• 1907 Institut de Zoologie din Munchen
• 1910 obtine doctoratul
• 1912 locotenent în corpul medical al armetei
• 1914 N.Y. în departamentul de Anatomie
• 1920 începe studiul citologiei vaginale
• 1943 publica monografia
• Februarie 1962 insuficienta cardiaca cu EPA.

6
Citologie? De unde?

• Toate zonele anatomice
• Citologia exfoliativa
• Citologia abraziva
• Punctie aspirativa cu ac fin
• Citologia sanguina si a maduvei hematogene

7
Citologia exfoliativa

• Se bazeaza pe desprinderea spontana a celulelor,
  de la suprafata unor organe, la nivelul unor
  cavitati.
• Celulele exfoliate sunt recoltate prin metode
  non-abrazive.
• Nu poate fi stabilita vârsta celulelor exfoliate.
• Diagnostic precoce în tumori cu localizare
  superficiala.
• Exemple
• Citologia vaginala
• Citologia sputei
• Citologia seroaselor
• Citologia urinara

8
Citologia exfoliativa- citologia vaginala-

• Citologia vaginala
• Evalueaza celule din zona fundului de sac
  posterior al vaginului, care provin din mai multe
  surse.
• Adesea contine pe lânga celule epiteliale
  descuamate si alte tipuri celulare
• leucocite si macrofage (cresc numeric în
  procesele inflamatorii)
• diverse microorganisme

9
Citologia exfoliativa

• Citologia sputei - colectie de material mucoid
  care contine celule provenite din
• cavitatea bucala
• faringe
• laringe
• trahee
• arborele bronsic
• alveolele pulmonare
• Citologia urinara
• Citologia seroaselor

10
Citologia seroaselor

• Lichidul este colectionat în containere sterile
  si transferat rapid în laborator.
• Stocare posibila la 4 grade Celsius (maxim 2
  zile)
• Volum satisfacator aproximativ 50 ml
• Se adauga în container peste lichidul de evaluat
  o solutie fixatoare (etanol 50).
• Regula solutia fixatoare trebuie sa aiba acelasi
  volum (sau putin mai mare) cu lichidul pentru
  evaluare
• Daca sunt lichide cu continut hemoragic se adauga
  în plus si un anticoagulant (heparina)
• Necesar 2 frotiuri/caz pentru diagnoastic
• Centrifugare uzual la 600 rotatii timp de 10
  minute.
• Lichidele decelabile clinic/imagistic patologice

11
Citologia exfoliativa- caracteristici -

• Citologia exfoliativa se caracterizeaza de
  prezenta celulelor din diverse surse.
• O caracteristica importanta slaba pastrare a
  unor tipuri celulare exfoliate
• unele celule se pastreaza relativ bine (ex.
  celulele scuamoase)
• Altele se altereaza usor (ex. celulele
  glandulare, leucocitele)
• Necesara fixarea rapida

12
Citologia abraziva

• Metoda este utilizata pentru a obtine prin
  abraziune, un numar sporit de celule direct de pe
  suprafata unui organ.
• Spatula cervicala a fost introdusa de Ayre în
  1947.
• Permite recoltarea celulelor de la nivelul
  epiteliului exocervical si endocervical
• Alte instrumente pentru citologia exfoliativa

13
Citologia abraziva
14
Frotiu de sânge periferic

• Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar)
• sânge capilar - arteriolar
• Strat subtire, uscare rapida la temperatura
  camerei
• Colorare
• Metoda de electie May-Grünwald-Giemsa (MGG)
• Alternative Wright, Romanowsky
• Metode citochimice peroxidaza, fosfatazele, PAS
• Metode imunocitochimice markeri leucocitari de
  membrana
• Examinare
• Obiectiv x40 sau x100 (imersie)
• Se urmareste
• aspectul general al frotiului
• morfologia eritrocitelor
• formula leucocitara

15
Frotiu de sânge periferic

• Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar)
• sânge capilar - arteriolar
• Strat subtire, uscare rapida la temperatura
  camerei
• Colorare
• Metoda de electie May-Grünwald-Giemsa (MGG)
• Alternative Wright, Romanowsky
• Metode citochimice peroxidaza, fosfatazele, PAS
• Metode imunocitochimice markeri leucocitari de
  membrana
• Examinare
• Obiectiv x40 sau x100 (imersie)
• Se urmareste
• aspectul general al frotiului
• morfologia eritrocitelor
• formula leucocitara

Recoltare la nou-nascut si copilul mic
16
Frotiu de sânge periferic

• Frotiul de sânge periferic (venos sau capilar)
• sânge capilar - arteriolar
• Strat subtire, uscare rapida la temperatura
  camerei
• Colorare
• Metoda de electie May-Grünwald-Giemsa (MGG)
• Alternative Wright, Romanowsky
• Metode citochimice peroxidaza, fosfatazele, PAS
• Metode imunocitochimice markeri leucocitari de
  membrana
• Examinare
• Obiectiv x40 sau x100 (imersie)
• Se urmareste
• aspectul general al frotiului
• morfologia eritrocitelor
• formula leucocitara

17
Sânge venos
Sânge capilar
18
Frotiu din aspiratul medular si/sau biopsie

• Aspiratul si biopsia cresta iliaca
  postero-superioara (corticala subtire)
• sigura
• riscul scazut de durere
• accesibilitate buna
• Alternative
• Creasta iliaca antero-superioara
• Doar aspirat
• Stern
• peste 12 ani, obeze
• Nivelul corespunzator celui de-al 2-lea si al
  3-lea spatiu intercostal
• Tibie
• la copii sub 1 an (anestezie generala)
• Suprafata proximala anteromediala

19
Frotiu din aspiratul medular si/sau biopsie

• Aspiratul si biopsia cresta iliaca
  postero-superioara (corticala subtire)
• sigura
• riscul scazut de durere
• accesibilitate buna
• Alternative
• Creasta iliaca antero-superioara
• Doar aspirat
• Stern
• peste 12 ani, obeze
• Nivelul corespunzator celui de-al 2-lea si al
  3-lea spatiu intercostal
• Tibie
• la copii sub 1 an (anestezie generala)
• Suprafata proximala anteromediala

20
Punctia aspirativa cu ac fin FNA (Fine Niddle
Aspiration)

• Diagnosticul tumorilor palpabile
• 1853 James Paget diagnosticul tumorilor mamare.
• Menetrier (1886) si Kronig (1887) diagnosticul
  tumorilor pulmonare.
• Câteva centre specializate.
• În 1925 Martin si Coley se implica în
  diagnosticul preoperator (peste 1000 cazuri)
• Mamare
• Ganglion limfatic
• Plamân
• Os
• Institutul Karolinska (Suedia) Nils Soderstrom
  si Josef Zajicek
• Tumori mamare, prostatice, tiroidiene, glande
  salivare, pulmonare
• Prezent tumori localizate profund
• Ghidaj eco, CT

21
FNA avantaje

• Nu impune pregatire speciala
• Fara anestezie specifica
• Elimina perioadele de asteptare
• Rapida, sigura
• Nedureroasa
• Ieftina
• Raportarea FNAB
• nesatisfacator
• benign
• malign
• suspicios

22
Realizarea preparatelor citologice

• Fixarea este o etapa foarte importanta
• Pentru cele mai multe cazuri, preparatele bine
  fixate si colorate adecvat sunt mai usor de
  interpretat decât cele care sunt uscate la aer.
• Trebuiesc preparate frotiuri în strat subtire si
  cu material uniform întins.
• Prepararea materialelor citologice prin periere
  sunt mai dificil de efectuat.
• Exceptând cazurile când este necesara uscarea
  preparatului la aer (ex. frotiurile sanguine),
  restul preparatelor citologice necesita fixare
  rapida cu solutie fixatoare specifica.
• Cel mai utilizat fixator pentru coloratia
  Papanicolaou alcool 95
• Durata optima a fixarii 15 minute
• Exista si fixatori tip spray.
• În cazul frotiurilor uscate se poate realiza
  rehidratarea acestora
• solutie apoasa de glicerina 3 minute
• 2 bai de alcool etilic 95
• etapele coloratiei Papanicolaou

23
Coloratiile fundamentalecoloratia Papanicolaou
(1942)

• Fixare în alcool etilic 95 - 15 min
• Apa distilata 1 min
• Hematoxilina Harris 6 min
• Apa distilata 2 minute
• Se scufunda de 6 ori în solutie apoasa de acid
  clorhidric 0,25
• Apa curgatoare 6 minute
• Limpezit în apa distilata (câteva secunde)
• Solutie alcol etilic de 50, 70, 80 si 95
  (câte 1 min)
• Colorare cu OG6 1,5 min
• Alcool 95 (2 bai a 0,5 min)
• Colorare cu EA 1,5 min
• Limpezire în alcool 95 (3 bai a câte 1 min)
• Deshidratare cu alcool etilic 100 - 1 min
• Amestec alcool-xilen (11) 1 min
• Xilen 1 min
• Montare balsam de Canada

• Durata totala
• 45 min preparatele nefixate
• 30 min preparatele fixate

24
Coloratiile fundamentalecoloratia APT-Dragan
(1968)

• Colorare cu solutia AP (albastru policrom) 15
  sec
• Spalare în doua bai de apa distilata sau de
  robinet 15 sec
• Diferentiere în solutia T (tanin 1) 15 sec
• Spalare în apa distilata sau de robinet 15 sec
• Montare balsam de Canada
• Carte Citodiagnostic cu metoda de colorare
  rapida APT-Dragan Editura de Vest, 2004

• Durata totala 60 sec

25
Imunocitochimia

• Are un mare potential de utilizare.
• Cazuri selectate.
• Imunocitochimia este utila în 70 din cazuri.
• Lichid pleural pentru diferentierea celule
  mezoteliale vs tumori metastatice (utila în 82
  din cazuri).
• Carcinom urotelial vs carcinom prostatic invadant
  în vezica/uretra.
• În cazul FNA este utila la 69 din cazuri.
• Fixarea optimala impune
• uscare preparatelor,
• apoi plasarea în solutie de formol salin 0,1
  peste noapte la 27grade C
• plasare în etanol 100 timp de 10 minute

26
Criterii de malignitate celulara

• Se bazeaza pe
• modificarile structurale ale celulelor
• interrelatiile perturbate dintre celule
• Diagnosticul histopatologic se bazeaza în
  primul rând pe modificarile arhitecturale.
• Diagnosticul citologic se bazeaza pe modificari
  ale celulelor individuale.
• Aspectul morfologic al celulelor de pe
  preparatele citologice difera semnificativ de
  cele evaluate pe preparatele histopatologice.
• Din acest motiv sunt necesare criterii de
  diagnostic citologic
• Criterii de malignitate
• generale
• modificari structurale ale celulei (nucleu,
  citoplasma)
• modificari ale interrelatiei cu alte celule
  (pentru grupuri de celule)
• criterii indirecte
• specifice

27
Criterii generale de malignitate1- modificari
structurale celulare- modificari nucleare -

• Crestere disproportionata a nucleului cu
  alterarea raportului N/C
• Normal celule endocervicale, din pelvisul renal
• Hipercromazia
• modificari degenerative
• supracolorare
• Pattern cromatinian aberant
• Elongat
• Contur neregulat
• Identatii profunde
• Lobulatie
• Cresterea dimensiunii si a numarului nucleolilor
• Multinucleere
• Activitate mitotica cu mitoze atipice
• Normal eroziuni cervicale, exudat
• Îngrosarea membranei nucleare
• Modificari degenerative vacuolizari anormale

28
Criterii generale de malignitate 1- modificari
structurale celulare - modificari citoplasmatice
-

• Accentuarea bazofiliei sau acidofiliei
• acidofilia în special pentru carcinomul
  scuamocelular
• apare si în leziuni non-tumorale
• Incluziuni citoplasmatice pigment, leucocite,
  resturi celulare
• Melanina (melanom malign)
• Incluziuni leucocitare (adenocarcinoame)
• Vacuolizari atipice în special în adenocarcinoame
• observate si în celule non-maligne (normale sau
  patologice) (ex celule endometriale)

29
Criterii generale de malignitate1- modificari
structurale celulare- modificari generale
celulare -

• Cresterea dimensiunii celulare peste limita
  normala acceptata
• Hipertrofia celulara se poate întâlnii si în
  conditii normale (ex celule endocervicale,
  pelvisul renal, celule prostatice)
• Aspecte aberante ale formei celulare cu elogari
  si forme bizare
• celula fibra
• Modificari necrotice si degenerative

30
Criterii generale de malignitate2- bazate pe
interrelatii celulare

• Iregularitati de pattern lipsa uniformitatii în
  ceea ce priveste orientarea celulei si a
  nucleilor
• Anizokarioza si anizocitoza
• Se refera la variatii ale dimensiunilor nucleare
  si celulare de acelasi tip dintr-un grup celular
• nu se refera la variatiile de marime ale
  celulelor individuale de pe frotiu
• Lipsa limitei celulare distincte
• prezenta si în celulele normale (ex celule
  endometriale)
• fixarea improprie
• Aglomerari de celule si nuclei
• Normal în celulele endometriale
• Canibalismul celular
• Formare de pattern-uri particulare
• Rozeta (adenocarcinoame)

31
Criterii generale de malignitate3- indirecte

• Prezenta sângelui cu eritrocite degenerate
• Absent în stadiile initiale ale proceselor
  maligne
• Excesul de limfocite (specimenele de sputa si
  lavajul bronhoalveolar)
• În agregate largi
• Numar crescut de histiocite
• Adenocarcinomul endometrioid
• si în conditii normale

32
Clasificarea frotiurilor(clasificarea
Papanicolaou)

• C I - absenta celulelor normale si atipice
• C II - citologie atipica dar fara evidenta
  aspectelor de malignitate
• C III - citologie sugestiva dar nu concluziva
  pentru malignitate
• C IV - citologie puternic sugestiva pentru
  malignitate
• C V - citologie concluziva pentru malignitate

33
Clasificarea frotiurilor cervico-vaginale(clasifi
carea Bethesda)

• Frotiu normal (corespunde C I)
• ASCUS (celule atipice scuamoase fara semnificatie
  cunoscuta) AGUS (celule atipice glandulare fara
  semnificatie cunoscuta) (corespunde C II)
• LGSIL (neoplazia intraepiteliala de grad
  scazut)(corespunde C III)
• HGSIL (neoplazia intraepiteliala de grad crescut)
  (corespunde C IV)
• Cancer (corespunde C V)