Biochemick

1
Biochemické vyšetrovací metody

• as. RNDr. Zdenek Fišar, CSc.
• Psychiatrická klinika 1. LF UK

2
Laboratorní vyšetrovací metody v psychiatrii

• Výchozí postulát
• Pri duševních poruchách dochází k narušení
  prenosu signálu v CNS.
• klasické a speciální biochemické a endokrinní
  testy
• imunologické testy
• elektroencefalografie (EEG)
• elektrokardiografie (EKG)
• pocítacová tomografie (CT)
• metody jaderné magnetické rezonance (NMR)
• genetická vyšetrení (mentální retardece,
  hyperkinetický syndrom, )
• falopletysmografie

3
Metodologické problémy

• V soucasné dobe není k dispozici biochemické (ani
  genetické) vyšetrení, na jehož základe by bylo
  možné jednoznacne diagnostikovat duševní poruchu
  a prípadne navrhnout optimální lécbu.
• Základní metodologický problém tedy spocívá ve
  skutecnosti, že v oblasti myšlení neexistují
  dostatecne citlivé a specifické merící metody. Je
  to dáno složitostí funkce mozku, kdy i jeho
  normální funkce zahrnují výrazné odchylky z
  rovnováhy.

4
Nekteré biochemické a neuroendokrinní testy
v psychiatrii

• hladiny psychofarmak
• hladiny neuromediátoru a jejich metabolitu
• neuroendokrinní parametry
• aktivita enzymu podílejících se na syntéze a
  metabolismu neuromediátoru
• vlastnosti receptorových systému
• zpetné vychytávání uvolnených neuromediátoru

5
Biologická psychiatrie

• Není dosud jasné, co je primární prícinou vzniku
  vetšiny duševních poruch a jaké jsou molekulární
  mechanismy vedoucí k terapeutickým úcinkum
  používaných léciv.
• Dosavadní pozorování svedcí o tom, že pri
  duševních poruchách je porušen normální prenos
  nervového signálu, a to zvlášte v oblasti
  chemických synapsí

6
Synapse
7
Chemická synapse prevod signálu
8
Prenašece pro neuromediátory
? - transportní protein závislý na Na/Cl- ? -
vezikulární transportní protein ? - transportní
protein závislý na Na ? - osmoticky regulovaný
transportní protein
9
Dusledky aktivity prenašecu
koncentrace neuromediátoru ve šterbine je snižována rychleji, než pri pouhé difúzi, což umožnuje lepší casové rozlišení následných deju
úcinky neuromediátoru jsou omezeny na menší plochu, což dovoluje funkci anatomicky blízkých chemicky identických ale funkcne odlišných synapsí
neuromediátor muže být po prenosu do presynaptického zakoncení znovu použit
10
Kritéria pro identifikaci neuromediátoru
výskyt ve vysokých koncentracích v presynaptických nervových zakonceních
syntéza v presynaptickém neuronu
uvolnování v dostatecném množství z neuronu pri depolarizaci membrány a existence mechanismu pro ukoncení jeho pusobení
indukce fyziologických úcinku odpovídajících normální synaptické transmisi i pri exogenní aplikaci
existence specifického receptoru pro tento neuromediátor
11
Klasické neuromediátory
Systém Mediátor Prekurzory
cholinergní acetylcholin cholinacetylkoenzym A
aminokyselinergní GABA glukóza ? glutamát
aminokyselinergní asparagová kys. glukózaglutamin glutamát
aminokyselinergní glutamová kys. glukózaglutamin aspartát
aminokyselinergní glycin serin
aminokyselinergní homocystein cystein?cystin
monoaminergní monoaminergní monoaminergní
katecholaminy dopamin tyrozin?DOPA?dopamin
katecholaminy noradrenalin ?noradrenalin?adrenalin
katecholaminy adrenalin
indolaminy tryptamin
indolaminy serotonin tryptofan?5-hydroxytryptofan
jiné odvozené od ak histamin histidin
jiné odvozené od ak taurin cystein?cysteamin
purinergní adenosin
purinergní ADP
purinergní AMP
purinergní ATP
12
Receptory

• Receptor je makromolekula specializovaná na
  prenos informace.
• Lze jej definovat jako specifické vazebné místo s
  funkcními vztahy.

13
Vlastnosti receptoru
Receptorový komplex
1. rozpoznávací místo
2. transdukcní prvek
3. efektorový systém
Regulace receptoru
1. regulace zmenou poctu receptoru
2. regulace vlastností receptoru
14
Rozdelení receptoru podle jejich efektorového
systému
ligandem rízené iontové kanály
receptory spojené s G proteiny
receptory s vnitrní guanylátcyklázovou aktivitou
receptory s vnitrní tyrozinkinázovou aktivitou
15
Schéma pro hypotézu druhých poslu
16
Typy receptoru
Mediátorový systém Receptorový typ
acetylcholinový acetylcholinové nikotinové receptory
acetylcholinový acetycholinové muskarinové receptory
monoaminový ?1-adrenoceptory
monoaminový ?2-adrenoceptory
monoaminový ?-adrenoceptory
monoaminový dopaminové receptory
monoaminový serotoninové receptory
aminokyselinový GABA receptory
aminokyselinový glutamátové ionotropní receptory
aminokyselinový glutamátové metabotropní receptory
aminokyselinový glycinové receptory
aminokyselinový histaminové receptory
peptidový opioidní receptory
peptidový jiné peptidové receptory
purinový adenosinové receptory (P1 purinoceptory)
purinový P2 purinoceptory
17
Podtypy monoaminových receptoru
RECEPTORY Podtyp Hlavní transdukcní mechanismus Hlavní transdukcní mechanismus Struktura (ak/TM)
?1-adrenoceptory ?1A Gq/11 ?IP3/DAG 466/7
?1-adrenoceptory ?1B Gq/11 ?IP3/DAG 519/7
?1-adrenoceptory ?1D Gq/11 ?IP3/DAG 572/7
?2-adrenoceptory ?2A Gi/o cAMP 450/7
?2-adrenoceptory ?2B Gi/o cAMP 450/7
?2-adrenoceptory ?2C Gi/o cAMP 461/7
?2-adrenoceptory ?2D Gi/o cAMP 450/7
?-adrenoceptory ?1 Gs ?cAMP 477/7
?-adrenoceptory ?2 Gs ?cAMP 413/7
?-adrenoceptory ?3 Gs, Gi/o ?cAMP 408/7
dopaminové D1 Gs ?cAMP 446/7
dopaminové D2 Gi Gq/11 cAMP ?IP3/DAG, ?K, ?Ca2 443/7
dopaminové D3 Gi cAMP 400/7
dopaminové D4 Gi cAMP, ?K 386/7
dopaminové D5 Gs ?cAMP 477/7
18
Podtypy monoaminových receptoru
RECEPTORY Podtyp Hlavní transdukcní mechanismus Hlavní transdukcní mechanismus Struktura (ak/TM)
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT1A Gi/o cAMP 421/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT1B Gi/o cAMP 390/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT1D Gi/o cAMP 377/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-ht1E Gi/o cAMP 365/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-ht1F Gi/o cAMP 366/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT2A Gq/11 ?IP3/DAG 471/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT2B Gq/11 ?IP3/DAG 481/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT2C Gq/11 ?IP3/DAG 458/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT3 interní kationtový kanál interní kationtový kanál 478
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT4 Gs ?cAMP 387/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-ht5A ? 357/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-ht5B ? 370/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-ht6 Gs ?cAMP 440/7
5-hydroxy- tryptaminové 5-HT7 Gs ?cAMP 445/7
19
Zpetnovazebné ovlivnování uvolnování
neuromediátoru
20
Propojení prenosových systému na postreceptorové
úrovni
21
Mechanismy úcinku antipsychotik
konvencní antipsychotika blokáda postsynaptických D2 receptoru v meso-limbické dráze
atypická antipsychotika blokáda postsynaptických D2 receptoru v meso-limbické dráze (potlacení pozitivních symptomu) zvýšené uvolnování DA a blokáda 5-HT2A receptoru v meso-kortikální dráze (potlacení negativních symptomu) vazba na další receptory (úcinnost v terapii afektivních symptomu, zlepšení kognitivních funkcí)
22
Rozdelení antidepresiv podle primárního
biochemického úcinku
inhibitory katabolismu neuromediátoru (IMAO)
blokátory reuptake neuromediátoru (SRI/NRI, SSRI, SNRI)
agonisté receptorových systému (5-HT1A)
antagonisté receptorových systému (?2-AR, 5-HT2)
inhibitory ci stimulátory jiných složek transdukce signálu (G proteinu, AC, PL, PK, fosfatáz, ATPáz, proteinu závislých na membránových fosfolipidech, transkripcních faktoru, systému 2. a 3. poslu)
23
Schizofrenie

• schizofrenie je specificky lidské onemocnení
  dosud neznámé etiologie projevující se poruchami
  myšlení, jednání, vnímání, emocí a vule
• jedná se onemocnení heterogenní etiologie
  (skupina schizofrenií)
• predpokládá se multifaktoriální etiologie a
  mnohocetné patogenetické vlivy

24
Environmentální modely schizofrenie
model vyvolávající faktory
psychosociální (s vyvolávajícím vlivem komplexních sociálních požadavku) situace vyžadující akci nebo rozhodnutí složitost, dvojznacnost ci nejasnost informací poskytovaných k vyrešení úkolu situace vyžadující akci nebo rozhodnutí pretrvává, aniž byla vyrešena osoba nemá možnost únikové cesty
nepsychosociální (se specifickým poškozením mozku a jeho funkcí) porodní komplikace nitrodeložní virová infekce citlivost na gluten malformace mozku, atd.
25
Neurovývojová hypotéza schizofrenie
Významná cást osob s diagnózou schizofrenie získanou v dospelém veku prodelala poruchu vývoje mozku desítky let pred symptomatickou fází onemocnení. Narušení vývoje mozku muže zpusobit bud takové poškození mozku, které se v dospelosti vlivem interakcí s dosud neznámými faktory projeví vznikem psychotických symptomu, nebo toto casné poškození CNS vede k ovlivnení dalšího vývoje mozku a vzniku náchylnosti ke schizofrenii v pozdejším veku
Tento model muže vysvetlit vysokou pravdepodobnost vzniku klinických projevu onemocnení v pozdní adolescenci nebo casné dospelosti úlohu stresu pri vzniku onemocnení a jeho relapsu terapeutickou úcinnost antipsychotik
26
Vývojová neuropatologie
vztah ke schizofrenii
mozkové morfometrické abnormality in vivo ponekud zvetšené mozkové komory a širší kortikální šterbiny a rýhy
mozkové morfometrické abnormality post mortem rozdíly ve velikosti mozkových komor, v ruzných oblastech kury, v hipokampální formaci (vc. parahipokampálního kortexu) a v ruzných periventrikulárních subkortikálních jádrech konzistentní data o chybení gliózy
mozkové morfometrické abnormality anomální lateralizace méne vyvinutá normální anatomická asymetrie hemisfér
abnormality cytoarchitektury orientace hipokampálních pyramidových bunek, laminární organizace neuronu v neokortexu a limbické kure, vzájemné vztahy mezi neurony
27
Východiska klasické dopaminové hypotézy
schizofrenie
Psychózu lze aktivovat psychostimulancii, která jsou agonisty dopaminu, jako je amfetamin, meskalin, dietylamid kyseliny lysergové (LSD, lysergid) jedná se zrejme o látky vhodné pro vyvolání modelového psychotického stavu.
Spolecným znakem látek úcinných pri terapii schizofrenie (neuroleptik, resp. antipsychotik 1. generace) je jejich pusobení na dopaminergní systém skoro všechny tyto léky pritom ovlivnují pozitivní príznaky, pravdepodobne tím, že blokují úcinky dopaminu a jiných dopaminergních agonistu v urcitých oblastech mozku.
Neuroleptika zvyšují obrat dopaminu muže se jednat o dusledek blokády postsynaptických DA receptoru, nebo nedostatecného poctu ci citlivosti inhibicních DA autoreceptoru na bunecných telech.
28
Klasická dopaminová hypotéza schizofrenie
Psychotické symptomy u schizofrenie jsou vztaženy k dopaminergní hyperaktivite v mozku. Hyperaktivita dopaminergních systému spojená se schizofrenií je dusledkem zvýšení citlivosti a poctu dopaminových D2 receptoru. Tato zvýšená aktivita se muže týkat jen urcité oblasti mozku.
29
Afektivní poruchy

• Afektivní poruchy se projevují patickou náladou
  v epizodách trvajících od nekolika dnu do
  nekolika mesícu. Pri bipolárním typu onemocnení
  dochází ke strídání depresivních a manických
  epizod, unipolární typ zahrnuje pouze epizody
  depresivní, nebo manické.
• Težká podoba postihuje asi 1 populace a je
  obvykle dobre lécitelná. Anatomické zmeny v mozku
  jsou podobné jako u chronické schizofrenie.

30
Prístupy biologické psychiatrie ke studiu
afektivních poruch
BIOLOGICKÉ BIOLOGICKÉ
genetika náchylnost k af. poruchám
stres zvýšená citlivost po opakování urc. událostí
chronobiologie desynchronizace biol. rytmu
NEUROCHEMICKÉ NEUROCHEMICKÉ
neuromediátory dostupnost
receptory pocet, afinita, senzibilita
postreceptorové procesy G proteiny, systémy druhých poslu, fosforylace a defosforylace, transkripce
IMUNONEUROENDOKRINNÍ IMUNONEUROENDOKRINNÍ
osa HPA zvýšená aktivita pri depresi
imunitní funkce ruzné zmeny pri depresi
31
Receptorové hypotézy afektivních poruch
Klasická noradrenalinová receptorová hypotéza Depresivní porucha muže být spojena se zvýšenou senzitivitou centrálních noradrenergních receptoru. Terapeutické úcinky antidepresiv jsou potom vztaženy k adaptivním zmenám v senzitivite adenylátcyklázového systému spojeného s postsynaptickými noradrenergními receptory. Tato hypotéza byla upresnena tím, že desenzitizace adenylátcyklázy po chronickém podávání antidepresiv je zpusobena snížením poctu ?1-adrenoceptoru.
Obecná katecholaminová hypotéza Supersenzitivita urcitých katecholaminových receptoru pri nízkých hladinách 5-HT je biochemickým základem deprese. Tato hypotéza je elegantní, ale nelze ji považovat za prokázanou, nebot klinické studie dostatecne nepotvrdily prítomnost takových supersenzitivních receptoru u nemocných.
Obecná serotoninová receptorová hypotéza Deprese je vztažena k temto abnormalitám serotoninových receptoru upregulace 5-HT2 desenzibilizace 5-HT1A abnormální transdukce signálu po vazbe 5-HT k receptoru.
32
Postreceptorové hypotézy afektivních poruch
Molekulární a bunecná teorie deprese Transkripcní faktor CREB je možným intrabunecným cílem dlouhodobé lécby antidepresivy a gen pro mozkový neurotrofní faktor BDNF je možným cílovým genem CREB. Náchylnost k depresi muže vzniknout v dusledku poškození neuronu po chronickém stresu, který snižuje expresi BDNF v hippokampu. Prežití neuronu snižuje také dlouhodobé zvýšení hladin glukokortikoidu, hypoglykémie, ischémie, neurotoxiny a nekteré virové infekce. Dlouhodobé podávání antidepresiv zvyšuje expresi BDNF i jeho receptoru trkB pres zvýšení funkce 5-HT nebo NA systému.
33
Model pro molekulární mechanismus úcinku
dlouhodobé lécby antidepresivy

• Antidepresivní terapie (AT)
• ?Inhibice reuptake 5-HT a NA nebo jejich štepení
• ?
• Krátkodobá AT
• ? Zvýšení mimobunecných hladin 5-HT nebo NA
• ?
• Dlouhodobá AT
• ? Snížení funkce a exprese 5-HT a NA receptoru
• ?Zvýšení prenosu v signální dráze cAMP (zvýšené
  hladiny adenylátcyklázy a PKA a translokace PKA
  do bunecného jádra)
• ?Zvýšení exprese transkripcního faktoru CREB
  (cAMP response element-binding protein)
  predpokládá se, že CREB je spolecným
  postreceptorovým cílem pro antidepresiva.
• ?
• Zvýšená aktivita v signální dráze cAMP naznacuje,
  že funkcní výstupy 5-HT a NA jsou upregulovány, i
  když urcité serotoninové a noradrenalinové
  receptory jsou downregulovány. Exprese BDNF
  (brain-derived neurotrophic factor) a trkB je
  také zvýšena po dlouhodobém podávání antidepresiv
  (? zvýšené prežití neuronu, jejich funkce a
  pretvárení synapsí)
• Duman et al. 1997

34
Nekteré biochemické a neuroendokrinní testy
v psychiatrii

• hladiny psychofarmak
• hladiny neuromediátoru a jejich metabolitu
• neuroendokrinní parametry
• aktivita enzymu podílejících se na syntéze a
  metabolismu neuromediátoru
• vlastnosti receptorových systému
• zpetné vychytávání uvolnených neuromediátoru

35
Merené vzorky

• moc
• krev
• mozkomíšní mok
• izolované bunky
• ruzné modelové systémy (bunecné a tkánové
  kultury, synaptosomy izolované ze zvírecích
  mozku, umelé membrány)

36
Hladiny psychofarmak I

• za metabolismus léciv, vcetne psychofarmak, jsou
  odpovedné predevším enzymy ze systému cytochromu
  P-450
• nejvýznamnejším zpusobem eliminace je vylucování
  ledvinami
• obecne dochází k rozdelení léciva mezi plazmu,
  krevní bunky, tkánový mok a bunky tkání, pricemž
  cást je vázána na bílkoviny, cást je kumulována
  v lipidových dvojvrstvách a cást zustává volná

37
Hladiny psychofarmak II

• merení hladin psychofarmak v krvi vychází
  z predpokladu, že tyto koncentrace korelují
  s koncentracemi v míste pusobení, tj. v mozku
• byla urcena tzv. terapeutická okna, tj.
  koncentracní rozmezí, v nichž jsou psychofarmaka
  obvykle úcinná

38
Hladiny psychofarmak III

• Úcinnost a toxicitu léciv lze charakterizovat
  radou farmakologických parametru
• strední úcinná dávka (ED50) vyvolává požadovaný
  efekt u 50 jedincu
• strední toxická dávka (TD50) zpusobuje urcité
  toxické príznaky u 50 pokusných zvírat
• strední smrtná dávka (LD50) vede k úhynu 50
  pokusných zvírat
• pro rozsah použitelných dávek se používají
  parametry jako terapeutická šíre (TD50 ED50
  nebo LD50 ED50) a terapeutický index (napr.
  LD50/ED50, LD5/ED95, TD5/ED95)

39
Hladiny psychofarmak IV

• clearance je definovaná jako množství plazmy
  (nebo krve) v ml, které se ocistí od sledované
  látky za jednotku casu

40
Lithium I

• podává se terapeuticky v akutní manické nebo
  depresivní epizode nebo profylakticky pri
  bipolární afektivní poruše
• aplikuje se perorálne ve forme uhlicitanu
  lithného. Obvyklá denní dávka je kolem 900 mg
• pri profylaktickém podávání by sérová hladina
  lithia nemela klesnout pod 0,4 mmol/l, obvykle se
  pohybuje v rozmezí 0,6 0,8 mmol/l. Terapeutické
  hladiny u mánie mohou dosahovat až 1,2 1,5
  mmol/l.

41
Lithium II

• Pred nasazením lithia
• krevní obraz a diferenciální pocet lymfocytu
• sedimentace erytrocytu
• vyšetrení na ionty (Na, K, Ca, Cl, Mg)
• vyšetrení renálních funkcí (urea, kreatinin,
  clearance kreatininu, )
• EKG
• EEG
• V prubehu lécby
• koncentrace lithia v plazme
• pulrocní kontroly (thyreotropní hormon, urea,
  kreatinin)

42
Kontrola užívání psychofarmak

• stanovení fenothiazinových neuroleptik a
  tricyklických antidepresív odvozených od
  imipraminu v moci Forrestovou zkouškou, kdy
  pouhým smísením moci a Forrestova cinidla lze
  z barevné reakce odhadnout užívanou denní dávku
  léku
• pro presnejší stanovování hladin psychofarmak se
  používají hlavne elektrochemické a
  chromatografické metody a radioimunoanalýza

43
Hladiny neuromediátoru a jejich metabolitu I

• merení hladin neuromediátoru a jejich metabolitu
  a aktivity enzymu podílejících se na jejich
  syntéze a katabolismu zustává užitecnou výzkumnou
  metodou sledování zmen aktivity
  neuromediátorových systému v mozku pri onemocnení
  a jeho lécbe

44
Hladiny neuromediátoru a jejich metabolitu II

• Sledovány jsou nejcasteji
• kyselina 5-hydroxyindoloctová (5-HIAA, hlavní
  metabolit serotoninu)
• 3-metoxy-4-hydroxyfenylglykol (MHPG, relativne
  selektivní metabolit noradrenalinu v mozku)
• kyselina homovanilová (HVA, hlavní metabolit
  dopaminu) a další

45
Neuroendokrinní testy

• neurochemické a neuroendokrinologické prístupy ke
  studiu duševních poruch se vzhledem
  k provázanosti obou systému vzájemne doplnují
• studována je predevším osa hypotalamus-hypofýza-ku
  ra nadledvin (HPA) a osa hypotalamus-hypofýza-štít
  ná žláza

46
Dexametazonový supresní test

• dexametazonový supresní test (DST) spocívá
  v perorálním podání dexametazonu v dávce kolem 1
  mg ve 23 hodin a merení kortizolémie následující
  den
• Byl navržen jako endokrinní test pro diagnózu
  težké depresivní epizody, nebot DST není úcinný u
  25-45 depresivních pacientu a úspešná lécba
  antidepresivy vede k obnove normální odezvy.

47
Fenfluraminový test

• fenfluraminový test se používá pro sledování
  aktivity serotoninergního systému v mozku
• d-Fenfluramin zvyšuje hladiny uvolneného 5-HT
  v mozku, což vede ke zvýšenému vyplavování
  prolaktinu z adenohypofýzy.
• test spocívá v podání 60 mg d-fenfluraminu s
  predchozím a následným merením prolaktinémie.
  Predpokládá se, že osoby v depresívní epizode
  mohou mít vyšší bazální prolaktinémii a menší
  zvýšení prolaktinu v odpovedi na podání
  fenfluraminu oproti kontrolám

48
Vlastnosti receptoru

• disociacní vazebná konstanta (Kd) se používá pro
  charakterizaci síly vazby ligandu k receptoru
  (menší hodnoty Kd pro specifická vazebná místa
  pritom znamenají vetší sílu vazby)
• vazebná kapacita (Bmax) vyjadruje množství
  maximálne navázaného ligandu vztažené obvykle na
  jednotkovou hmotnost membránových proteinu
• disociacní konstanta a vazebná kapacita jsou
  základní veliciny pro charakterizaci vztahu
  struktura-funkce pri interakcích léciva se
  specifickým receptorem

49
Vlastnosti prenašecu pro neuromediátory

• maximální rychlost transportu do bunky (Vmax)
  odráží existenci saturovatelného množství
  prenašecu
• zdánlivá Michaelisova konstanta (Km) je
  definovaná jako hodnota koncentrace
  transportované látky, pri níž dosahuje rychlost
  transportu do bunky poloviny Vmax Km
  charakterizuje afinitu prenašece
  k neuromediátoru.
• rada psychofarmak, predevším antidepresiv, pusobí
  inhibicne na reuptake serotoninu, noradrenalinu
  nebo dopaminu jak do presynaptických nervových
  zakoncení v mozku, tak do bunek izolovaných
  z jiných tkání