Folie 1

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Schülerkongress GBM-Tagung in Münster
21.09.04 9.00 12.30 Uhr
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Tagesablauf
1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min
2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der
DNA im Agarose- Gel 40 min 3.
Schneiden des Plasmids 45 min 7.
Auswertung 4. Vorbereitung der Proben für die
8. Vorstellung weiterer Ergebnisse
Gelelektrophorese 20 min

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Pipettenbedienung
4
Gelvorbereitung
5
Schneiden des Plasmids
pUCD-lacZ mit BanII
6
Elektrophoretische Trennung der
geschnittenen DNA
7
Escherichia coli

• Bewegliches Stäbchenbakterium
• Natürliches Habit
• Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm)
• Wasserindikator für fäkale
• Verunreinigungen
• Haustier der Wissenschaft
• Verwendeter Stamm in Experimenten
• Sicherheitsstamm K12 (JM109)
• Außerhalb Labor nicht lebensfähig
• (bestimmte Eigenschaften fehlen)
• Kein genetisch veränderter
• Mikroorganismus
• (natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)

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Weitere Bakterien
Desulfovibrio sp.
Vibrio cholerae
Leptospira ssp.
Salmonella enteriditis
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Was ist DNA/DNS?
DesoxyriboNucleinSäure Helikaler Doppelstrang 4
Basen Adenin, Thymin Guanin, Cytosin Gene
informationstragende Abschnitte für
Proteinbiosynthese 1 Codon aus 3 Nukleotiden
entspricht 1 Aminosäure
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ProteinbiosyntheseVom Gen zum Protein
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Was sind Restriktionsenyzme?
Proteine (Eiweiße) Schneiden DNA an
spezifischen Erkennungssequenzen (oft Palindrome)
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Was sind Plasmide?
Neben chromosomaler DNA oft zirkuläre
DNA-Fragmente in Bakterien Sicherheitsplasmide
Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle
Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZ Ampr
Ampicillinresistenz-Gen Ori Replikationsursprung
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Historie
1865 Mendel 1869 Miescher 1944 Entdeckung der
DNA als Trägersubstanz des Erbguts
(Avery) 1953 Entdeckung der doppelhelikalen
Struktur der DNA (Watson und Crick) 1973 1.
rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und
Chang 1977 Gentransfer eines humanen Gens auf ein
Bakterium (Insulingen) 1982 Insulin als 1.
gentechnisches Produkt auf Markt 1983 1.
Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine
Pflanze (Tabak) 1985 PCR (Mullis) 1988 Gründung
von HUGO (Human Genome Project) 2000 Entschlüssung
des humanen Genoms von Craig Venter
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Bedeutsamkeit

• Rekombinante Proteine in therapeutischen und
  diagnostischen Anwendungsgebieten
• - RecHormon (Erythropoietinblutbildendes Hormon)
• - Reteplase (tPAPlasminogen Aktivator )
• - Insulin
• - Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring)
• - Teststreifen für Urin

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Analyse von DNA

• Agarosegel (molekularer Sieb)
• kleinere Fragmente wandern schneller als größere
  Fragmente durch das Agarosesieb.
• Negative Ladung gt Wanderung im Spannungsfeld
  zur Anode (pos. Pol)
• Wanderungsgeschwindigkeit linearer
  doppelsträngiger DNA- Moleküle umgekehrt
  proportional zum Logarithmus ihrer Größe

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Auswertung

• Vergleich mit bekanntem Bandenmuster
• DNA- Fragmente (DNA-Molekulargewichtsstandard)
• BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp)
• 3 Fragmente erwartet
• Berechnung der Größe anhand Plasmidkarte
• 2504 bp, 2116 bp, 1049 bp

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erwartete Ergebnisse
21226 548047324268 3530 20271904 1584 1375 9
47 831 564
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Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil)

• Klonierung eines DNA-Fragments ( Einschleusung
  eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe
  eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1
  Klon entsteht
• 1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment,
  Ligation
• 2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur
  1 von 10 000 nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen
  defekt ist
• 3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin
  (Plasmid enthalten) und über X-Gal (Spaltung zu
  blauem Farbstoff, Gen erfolgreich eingeschleust)

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Klonierung vonDNA-Fragmenten
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Tipps und Tricks zur Versuchsplanung

• Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten
• Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 C
• mehrere Wochen bei 20 C
• 1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT
• Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie
• ca. 1 Woche im Kühlschrank
• Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer
• mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage
• Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt
• mehrere Wochen bei 20 C
• Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3
  Tage
• Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt
• mehrere Woche bei RT
• Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso
  gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)