TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE

1
TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE
2
TRANSPLANTUL

• Actul de a transfera celule, tesuturi sau
  organe dintr-o parte in alta, fie de la acelasi
  individ, fie intre indivizi diferiti
• Tipuri
• Autogrefa transplantul de tesuturi proprii
  dintr-o parte in alta a aceluiasi individ
• Alogrefa transplantul de tesuturi de la un
  donor genetic diferit de acceptor, dar care
  apartine aceleiasi specii
• Xenogrefa transplantul de tesuturi de la un
  donor care apartine unei alte specii

3
ISTORIC

• Secolul II
• India, autogrefa, piele, rinoplastie
• Secolul III (??)
• Inlocuirea membrului inferior gangrenos al
  imparatului Iustinian cu cel al unui cadavru
• 1959
• Boston, rinichi, gemeni bizigoti
• 1967
• Denver, ficat
• 1968
• Cape Town, inima Minneapolis, maduva
  hematopoetica

4
CONDITII TRANSPLANT

• Compatibilitate AB0
• Identitate HLA cat mai mare
• Absenta in serul pacientului a unor Ac anti-donor
• Stimulare slaba la reactia mixta limfocitara

5
COMPATIBILITATE AB0

• Incompatibilitate minora
• Donorul are Ac (aglutinine)
• Exemplu donor 0 si primitor A/B/AB
• Incompatibilitate majora
• Donorul are Ag
• Exemplu donor A/B/AB si primitor 0
• Incompatibilitate minora si majora
• Exemplu donor A/B si primitor B/A
• Nu este esentiala
• Obiectiv prevenirea hemolizei post-transplant

6
COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

• MHC
• La om HLA (human leucocyte antigen)
• Grup inrudit de gene pe cromozomul 6
• Roluri
• Imunitate celulara
• Imunitate umorala
• Mecanisme de recunoastere intercelulara
• Discriminare self / nonself

7
ORGANIZAREA HLA

• 3 clase HLA
• Clasa I
• Glicoproteine membranare
• Celule nucleate
• Prezentarea Ag peptidice endogene LT citotoxice
• Clasa II
• Glicoproteine membranare
• CPA
• Prezentarea Ag exogene LT helper
• Clasa III
• Proteine cu functie in imunitate

8
GENELE HLA
9
POLIMORFISM GENIC

• Clasa I
• HLA A 451 alele
• HLA B 782 alele
• HLA C 238 alele
• Clasa II
• HLA DR 525 alele
• HLA DQ 105 alele
• HLA DP 147 alele
• (HLA DM 11 alele)
• (HLA DO 21 alele)

10
CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

• Se testeaza cel putin 3 locusuri
• HLA-A
• HLA-B
• HLA-DRB1
• 6 Ag
• 4 identice

11
CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE
12
TESTE DE HISTOCOMPATIBILITATE

• Moleculare
• Serologice
• Celulare

13
METODE MOLECULARE

• Leucocite din sange
• Extractia ADN-ului
• Amplificarea genelor HLA
• PCR-SSP
• PCR-SSOP
• SBT
• Interpretarea rezultatelor

14
PCR-SSP

• PCR-SSP (Sequence Specific Primers)
• Pentru HLA clasa I si II
• Amplificarea genelor HLA utilizand primeri
• Rezolutie mica se amplifica grupuri de alele
• Rezolutie inalta se amplifica alele specifice
• Electroforeza pe gel de agaroza a produsilor de
  amplificare
• Deplasare in functie de dimensiuni
• Comparare cu marker
• Citirea si interpretarea rezultatelor
• Apare banda specifica doar daca exista alela

15
PCR-SSP
16
PCR-SSOP

• PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide
  Probes)
• Amplificarea intregului exon
• Hibridizarea produsului de amplificare cu
  secventa complementara
• Vizualizarea strip-urilor cu benzi
• Interpretarea computerizata
• Rezolutie scazuta

17
PCR-SSOP
18
SBT

• SBT (Sequence Based Typing)
• Rezolutie maxima
• Amplificarea genei de interes
• Secventializare
• Confruntare cu baza de date alele compatibile
• Detectarea unor alele noi

19
SBT
20
METODE SEROLOGICE

• Utilizeaza seruri cu concentratii mari de Ac
  anti-HLA specifici
• Femei multipare
• Lichid placentar
• Pacienti cu transplante de organ sau transfuzii
  multiple
• Ac monoclonali

21
METODA DE LUCRU

• Separarea limfocitelor prin centrifugare in
  gradient de densitate
• Ser cu Ac anti-HLA in godeuri
• Se adauga suspensie limfocitara in fiecare godeu
  (complexe Ag-Ac)
• Se adauga complement (ser de iepure)
• Daca s-au format complexe ? se activeaza
  complementul ? liza osmotica a celulelor
• Se adauga colorant vital (eozina)
• Se citeste la microscop cu contrast de faza

22
INTERPRETAREA REZULTATELOR

• Limfocite vii necolorate, stralucitoare,
  refractile
• Limfocite moarte umflate, rosu inchis
• Pentru fiecare godeu limfocite moarte
• Martor negativ lt10 moarte
• Martor pozitiv 100 moarte

23
INTERPRETAREA REZULTATELOR
limfocite moarte/godeu Scor Interpretare
0-10 1 Negativ
11-20 2 Dubios
21-50 4 Slab pozitiv
51-80 6 Pozitiv
81-100 8 Intens pozitiv

• Identificarea serurilor care au reactionat cu
  suspensia limfocitara
• Toate serurile cu specificitatea respectiva
  trebuie sa dea reactie pozitiva (gt50 limfocite
  moarte)

24
TIPIZARE HLA-A
Numele serului Specificitati Scor
A-001 A1 1
A-002 A1, Aw36 1
A-003 A1, A11 1
A-004 A2 1
A-005 A2, A28 6
A-006 A2, A28, A7 8
A-007 A3 8
A-008 A3, A4 6
A-009 A3, A10, A11, Aw19 8
A-010 A11 1
A-011 A10, A11 1
A-012 A1, A3, A11 4
Interpretare fenotip HLA A28, A3
25
TIPIZARE HLA-B
Numele serului Specificitati Scor
B-001 B51, Bw52, B35 1
B-002 B51, Bw52 1
B-003 Bw51, Bw52, Bw53 1
B-004 B7, Bw42 8
B-005 B7, B27 8
B-006 B7, B55 8
B-007 B8 1
B-008 B8, Bw59 2
B-009 B44, B45, B21 6
B-010 B44, B45 8
B-011 B44 8
B-012 B45 1
26
SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HLA

• Detectarea Ac anti-HLA din sangele primitorului
• Metoda de lucru
• Suspensie de leucocite cu HLA cunoscut in godeuri
• Se adauga ser de la primitor (complexe Ag-Ac)
• Se adauga Ac anti-Fc
• Se adauga complement (ser de iepure)
• Daca s-au format complexe ? se activeaza
  complementul ? liza osmotica a celulelor
• Se adauga eozina si se citeste la microscop

27
INTERPRETAREA REZULTATELOR

• Limfocite vii necolorate, stralucitoare,
  refractile
• Limfocite moarte umflate, rosu inchis
• Pentru fiecare godeu limfocite moarte
• ?Ac anti-HLA ? ?probabilitatea de a gasi un
  donator compatibil

28
REACTIA MIXTA LIMFOCITARA

• MLR (Mixed Lymphocyte Reaction)
• LT ale unei persoane (P1) raspund la Ag HLA de pe
  limfocitele unei alte persoane (P2)
• Stimulare Ag ? proliferare limfocitara (sinteza
  crescuta de ADN)
• Unidirectionala se blocheaza proliferarea
  limfocitelor P2 si se analizeaza proliferarea
  limfocitelor P1
• Bidirectionala P1 si P2 se stimuleaza reciproc
  si se insumeaza raspunsurile

29
TESTUL DE LIMFOTOXICITATE MEDIATA CELULAR

• Se realizeaza o reactie mixta unidirectionala ?
  populatie de limfocite citotoxice activate (P1)
  impotriva limfocitelor P2
• P1 se pune in contact cu limfocite P2 marcate cu
  51Cr
• Se masoara 51Cr eliberat (comparativ cu celule
  51Cr nespecifice de la o alta persoana)
• Simulare transplant

30
PROBLEME LEGATE DE HLA

• Rejetul transplantului din cauza LT ale
  primitorului care recunosc HLA necompatibile
• Factori care influenteaza rejetul
• Sarcina, transfuzii
• Incompatibilitate HLA
• Terapie pre-transplant mai putin agresiva
• Terapie imunosupresoare post-transplant
  suboptimala
• Depletia LT din grefele de maduva osoasa
• Clasa I ? tolerarea grefei
• Clasa II ? GVHD

31
REACTIA GREFA CONTRA GAZDA

• GVHD (Graft Versus Host Disease)
• transplantarea de tesuturi imunocompetente
  (celule stem hematopoetice), necompatibile cu
  tesuturile primitorului in gazde imunodeprimate
  patologic sau farmacologic (medicatie
  imunosupresoare)
• Celulele imune din grefa recunosc moleculele HLA
  ale gazdei ca fiind straine ? raspuns imun
  impotriva celulelor gazdei

32
REACTIA GREFA CONTRA GAZDA

• GVHD acut
• lt100 zile post-transplant
• Piele, mucoase, plamani, ficat, tract
  gastro-intestinal
• GVHD cronic
• gt100 zile post-transplant
• Piele, mucoase, plamani, ficat, tract
  gastro-intestinal, glande exocrine, tesut
  conjunctiv
• Corticoterapie

33
GVHD ACUT
Eritem palmar
34
GVHD ACUT
Ulceratii ale mucoasei bucale
35
GVHD ACUT
Degenarea stratului bazal, keratinocite necrozate
36
GVHD CRONIC
Papule confluente hiperpigmentate
37
GVHD CRONIC
Placi sclerotice hiperpigmentate
38
GVHD CRONIC
Modificari lichenoide difuze ale buzelor
39
GVHD CRONIC
Hiperkeratoza, hipergranuloza, acantoza,
degenerarea stratului bazal