Diapositive 1

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La Cytométrie en flux
2
La cytométrie en flux

• La Cytométrie
• Mesure des cellules
• Comparaison déchantillons
• Paramètres physiques
• Paramètres chimiques (sondes fluorescentes)
• Paramètres biologiques
• Microscope, photos numériques

• Le Flux
• Dénombrement de particule
• Passage une à une devant le détecteur
• Liquide en mouvement

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La cytométrie en flux

• Le Principe
• Le laser
• La focalisation hydrodynamique
• La focalisation du laser
• La diffraction du laser
• Séparation des signaux
• Les résultats

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La cytométrie en fluxLe principe le laser

• laser Argon 488nm
• Raie lumineuse monochromatique
• Un seul type de photons (dans le bleu)
• Forme elliptique après focalisation
• Faisceau déclairement très concentré

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La cytométrie en fluxLe principe la
focalisation hydrodynamique
P2gtP1
d1 gtgt d2
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La cytométrie en fluxLe principe la
focalisation hydrodynamique

• Manchon liquidien 50 à 100 µm
• Suspension cellulaire 10 à 15 µm

• 1 ml de cellules 106/ml
• 12 µm de diamètre
• colonne de cellules de 9 km
• 1 cellule / 0.9 cm

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La cytométrie en fluxLe principe la
focalisation du laser
FOCALISATION LASER

• Le diamètre d'un faisceau laser 0,7 mm
• peu précis

Lentilles de focalisation

• 2 lentilles permettent de
• focaliser le laser de manière à
• obtenir un faisceau elliptique
• proche, en taille, des événements
• à analyser
• TRES PRECIS

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La cytométrie en fluxLe principe la diffusion
axiale
9
La cytométrie en fluxLe principe la diffusion
axiale

• Diffusion dans laxe
• Forward scatter (FS, FSc)
• Diffraction
• Réflexion /-
• Réfraction /-

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La cytométrie en fluxLe principe la diffusion
latérale
Réflexion
Réfraction
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La cytométrie en fluxLe principe la diffusion
latérale

• Diffusion à angle droit
• Side scatter (SS, SSc)
• Diffraction -
• Réflexion
• Réfraction

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La cytométrie en fluxLe principe la
diffraction du laser
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La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux

• Spécificité relative
• Fluorochrome spécifique pour un constituant de la
  cellule
• Toutes les cellules marquées
• Ac.Nucléiques
• Protéines
• Ions

• Spécificité absolue
• Fluorochrome lié à une molécule biologique
• Substrat fluorogène
• Ligands FC, AnV, lectines
• Anticorps

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La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux
Sondes fluorescentes plusieurs fluorescences
pour chaque cellule
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La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux

• Filtres colorés absorbants

• Filtres interférentiels
• Miroirs dichroïques

16
La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux
?
17
La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux
D1
D2
D1, D2, photomultiplicateurs
18
La cytométrie en fluxLe principe la séparation
des signaux
19
La cytométrie en fluxLes résultats la chaîne
dacquisition
eV
h?
Ampli
20
La cytométrie en fluxLes résultats
Digitalisation / Histogramme
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La cytométrie en fluxLes résultats analyse
dhistogramme

• N
• Moy, CV, ...

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- graphe - courbe - profil
Histogramme de Distribution
Spectre de fluorescence
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La cytométrie en fluxLes résultats

• Représentation des résultats sous forme
  dhistogrammes de distribution de fréquence.
• Analyses de populations dans des échantillons
  hétérogènes

?
24
La cytométrie en fluxLes résultats Histogramme
bi paramétrique
25
La cytométrie en fluxLes résultats Histogramme
bi paramétrique
26
La cytométrie en fluxLes résultats Combinaison
de paramètres
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La cytométrie en fluxLes résultats
Conditionnement de lanalyse
28
La cytométrie en fluxLes résultats
Conditionnement couleur
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La cytométrie en fluxSynthése
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La cytométrie en fluxLes résultats
immunofluorescence

• Excellente spécificité (Ac) théorique
• Nombreux contrôles nécessaires
• Spécificité de lAnticorps
• Fixation non spécifique pour lantigène
• Affinité

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La cytométrie en fluxLes résultats Le contrôle
négatif
Lecture dérivée des observations au microscope
Ac négatif
Ac marqueur
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La cytométrie en fluxApplications Analyse CD4
/ CD8
Sang Lyse des GR
Anti-CD8
Anti-CD4
33
La cytométrie en fluxApplications Analyse CD4
/ CD8
65
20
34
La cytométrie en fluxApplications Analyse des
leucémies
35
La cytométrie en fluxApplications Analyse du
cycle cellulaire

• Marqueurs de lADN
• Intercalants
• Spécificité relative

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La cytométrie en fluxApplications Analyse du
cycle cellulaire
Fluorescence proportionnelle à ADN
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La cytométrie en fluxApplications Analyse de
lapoptose

• Marqueurs membranaires
• Marqueurs mitochondriaux
• Marqueurs enzymatiques

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La cytométrie en fluxApplications Marquage
Annexine V-FITC
-phospatidylsérines
Intactes
-Annexine V-FITC
Apoptose
rouge
Nécrose
Iodure de propidium
vert
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La cytométrie en fluxApplications Marquage
Annexine V-FITC / IP
Apotose tardive ou nécrose
Apotose
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La cytométrie en fluxLe tri par CMF

• Cellules en suspension dans un jet de liquide
• Formation de goutellettes
• Charge Electrostatique
• Déviation des gouttelettes

41
La cytométrie en fluxLe tri par CMF La
formation de gouttelettes

• Technologie dérivée des imprimante à jet
  d encre
• Jet de liquide instable dans l air ?
  gouttelettes
• Oscillations modifient le point de rupture

42
La cytométrie en fluxLe tri par CMF La
formation de gouttelettes
30kHz
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La cytométrie en fluxLe tri par CMF La Charge
des gouttelettes
44
La cytométrie en fluxLe tri par CMF La
déviation des gouttelettes
0
3000 V
45
(No Transcript)
46
(No Transcript)
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La cytométrie en fluxLe tri par CMF

• Technique longue
• Sélection sur plusieurs paramètres à la fois
• Choix entre pureté et rendement
• Bonne pureté gt95
• Clonages
• Préparations pour
• Mise en culture
• Biologie moléculaire
• Western blots
• Activité enzymatiques
• Etc

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La cytométrie en fluxLe tri par CMF Tri des
cellules NK
Enricht rosette
Tri CMF
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La cytométrie en fluxLe tri par CMF Inhibiteurs
des caspases
Jurkat 7C11