CELLULE STAMINALI

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CELLULE STAMINALI

• Gigliola Sica
• Direttore dellIstituto di Istologia ed
  Embriologia
• della Facoltà di Medicina e Chirurgia
• Università Cattolica del Sacro Cuore
• Roma, Italia.

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Cellule staminali Laggettivo staminale
deriva dal latino stamen (stame) che significa
letteralmente ordito del telaio filo. In
botanica lo stame è il filamento la cui parte
terminale contiene il polline. Il greco stemon
riconduce alla radice di stare nel senso di
essere ritto.
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Linglese stem indica la parte principale di
una pianta, che ne costituisce lasse portante
che supporta foglie, fiori e frutti.
4
(No Transcript)
5
Laggettivo staminale sta a significare,
pertanto, ancestrale, che precede, nel caso
specifico delle cellule, altri elementi cellulari.
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Le cellule staminali sono elementi provvisti di
due caratteristiche principali 1) la
capacità di autorinnovamento illimitato o
prolungato e cioè di riprodursi senza
differenziarsi2) la capacità di dare origine a
cellule progenitrici di transizione con
attitudine proliferativa limitata, dalle quali
discendono popolazioni di cellule altamente
differenziate.
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Le cellule staminali e quelle progenitrici
specifiche sono morfologicamente e
citochimicamente indistinguibili.Sono cellule
rotonde, con una sottile rima di citoplasma
basofilo e nucleo con 2 o più nucleoli.
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Le cellule staminali possono essere distinte da
quelle progenitrici sulla base dei livelli di
espressione di alcuni geni e di alcune proteine.
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Nel corso della differenziazione la progenie
delle cellule progenitrici di alcune linee
cellulari procede attraverso una serie di fasi
intermedie morfologicamente distinguibili in base
alle dimensioni, alla configurazione nucleare,
alle proprietà tintoriali e alla presenza o
assenza di granulazioni citoplasmatiche.
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Cellule staminali
Sorgenti1) embrioni nei primi stadi dello
sviluppo ottenuti mediante fecondazione
in vitro a scopi riproduttivi o specificamente
per la ricerca
2) embrioni ottenuti inserendo il nucleo di una
cellula adulta in una cellula uovo, privata del
suo nucleo
3) organi di un feto abortito
4) cordone ombelicale
5) liquido amniotico
6) tessuti adulti.
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Le cellule staminali sono caratteristiche degli
embrioni, ma sono presenti anche negli organi di
individui adulti in piccola quantità.
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Le cellule staminali embrionali possono derivare
a) dalle cellule germinative primordiali, che
alla fine si differenziano in spermatozoi e
ovociti. b) dalla blastocisti.
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(No Transcript)
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La preparazione di cellule staminali embrionali
umane implica
1) la produzione di embrioni umani e/o
lutilizzazione di quelli soprannumerari da
fecondazione in vitro o crioconservati
2) il loro sviluppo fino allo stadio di
blastocisti
3) il prelievo della massa cellulare interna, il
che implica la distruzione dellembrione.
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4) la messa in coltura di tali cellule su uno
strato di fibroblasti irradiati (feeder
layer) e in un terreno di coltura adatto,
dove esse si moltiplicano fino alla formazione
di colonie che poi confluiscono
5) ripetuti passaggi, fino alla formazione di
linee cellulari capaci di moltiplicarsi,
conservando le caratteristiche delle
cellule staminali.
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Questo è, tuttavia, solo il punto di partenza
per la preparazione di linee cellulari
differenziate, ossia di cellule le quali
possiedono le caratteristiche che assumono nei
diversi tessuti, es. muscolari, nervose,
ematiche, etc.
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Lo step successivo è lorientamento in coltura
del differenziamento, mediante fattori di
crescita. Questa operazione non è facile, visto
che non conosciamo completamente i meccanismi
che lo sottendono.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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"Human embryonic stem cells that are becoming
epithelial cells, as indicated by the presence of
a protein called cytokeratin (in green). The
nuclei are stained blue." From Growing Stem
Cells (Genome News Network) Research by Daniel G
Anderson, Shulamit Levenberg  Robert Langer at
the Massachusetts Institute of Technology.
21
(No Transcript)
22
Per quel che riguarda le cellule ottenute da
feti abortiti, il loro uso equivarrebbe a quello
di organi prelevati da cadavere. Le cellule così
ottenute non hanno fornito dati conclusivi sulla
loro capacità di dare vita a diversi tessuti.
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Le cellule staminali ottenute dai vasi del
cordone ombelicale permetterebbero teoricamente
di creare banche personalizzate per ciascun
neonato, una riserva biologica da utilizzare
anche a distanza di tempo per curare malattie. Ad
oggi queste cellule hanno dato origine solo a
cellule del sangue non è dimostrata la capacità
di dare vita ad altri tessuti.
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Prelievo di cellule staminali da cordone
ombelicale
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Caratteristiche delle cellule staminali ottenute
dal liquido amniotico

• Clonal human AFS cells have a normal
  karyotype and retain long telomeres.(a) Giemsa
  band karyogram showing chromosomes of late
  passage (gt250 p.d.) cells. (b) Flow cytometry of
  late passage cells showing DNA stained with
  propidium iodide. G1 and G2/M indicate 2n and 4n
  cellular DNA content, respectively. S indicates
  cells undergoing DNA synthesis, intermediate in
  DNA content between 2n and 4n. (c) Conserved
  telomere length of AFS cells between early
  passage (20 p.d., lane 3) and late passage (250
  p.d., lane 4). Short length (lane 1) and high
  length (lane 2) telomere standards are provided
  in the assay kit. Marker lengths are indicated.
  p.d., population doubling.
• Nature Biotechnology - 25, 100 - 106 (2007).

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(No Transcript)
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(No Transcript)
28
Cellule staminali adulte
In molti tessuti sono presenti cellule staminali
capaci, sostanzialmente, di dare origine solo a
cellule del tessuto da cui provengono.Tuttavia,
in vari tessuti umani (midollo osseo, cervello,
mesenchima) si trovano cellule staminali
pluripotenti capaci di dare origine a più tipi di
cellule, in maggioranza ematiche, muscolari e
nervose.
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Nel midollo le cellule staminali da cui derivano
le varie linee di cellule ematiche, che hanno
come marcatore il CD34, ove purificate, possono
ricostituire lintera popolazione ematica in
pazienti trattati con chemioterapia o
radioterapia.
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Cellule staminali emopoietiche
Le cellule emopoietiche pluripotenti
corrispondono a meno dello 0,2 della popolazione
totale delle cellule nucleate del midollo.La
maggior parte di esse è in fase quiescente e
riprende a dividersi solo in risposta a richieste
di nuove cellule sanguigne.
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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(No Transcript)
34
Le cellule germinative primordiali danno origine
agli spermatogoni che sono di due tipiA, che
si dividono per mitosi e forniscono una riserva
continua di cellule staminaliB, che danno
origine agli spermatociti primari.
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Alcune cellule di tipo A abbandonano la
popolazione di cellule staminali e danno origine
a generazioni successive di spermatogoni,
progressivamente più differenziate.Al termine
dellultima divisione delle cellule A si formano
gli spermatogoni di tipo B e da essi derivano gli
spermatociti primari.
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Fra le cellule del colletto delle ghiandole
gastriche è presente un modesto numero di cellule
staminali che governano il rinnovamento continuo
della mucosa.Esse migrano verso lalto per
rimpiazzare le cellule mucose superficiali e
verso il basso per formare cellule ossintiche e
cellule principali.
37
(No Transcript)
38
Lepitelio cilindrico pseudostratificato ciliato
dellapparato respiratorio presenta cellule
basali. Sono considerate cellule staminali
destinate a rimpiazzare le cellule ciliate e le
cellule caliciformi.
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Il tessuto adiposo rappresenta una ulteriore
fonte di cellule staminali che possono dar vita a
cellule ossee e muscolari.
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Cellule staminali sono presenti nel tessuto
nervoso dei mammiferi in via di sviluppo e nel
sistema nervoso dei mammiferi adulti, incluso
luomo.
41
Le cellule staminali ottenute dal tessuto nervoso
fetale e dal tessuto nervoso adulto del topo, del
ratto o anche delluomo crescono bene in coltura
e, quando introdotte nellencefalo di animali da
esperimento, mostrano capacità di migrazione e
sostituzione di aree danneggiate.
42
Neoregulina e proteina 2 osteomorfogena guidano
lo sviluppo di cellule staminali nervose
neuroni e glia o cellule muscolari lisce.
43
(No Transcript)
44
Limpiego di cellule staminali pone, tra gli
altri, il problema della tumorigenicità e quello
della incompatibilità immunologica.
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Per superare il problema della incompatibilità
immunologica si è arrivati alla clonazione
terapeutica. Il termine clone indica la
produzione di copie tutte uguali di una cellula o
di un tratto di DNA.
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La locuzione clonazione terapeutica indica il
potenziale uso della tecnica del trasferimento
nucleare per ottenere cellule, tessuti ed organi
per pazienti che necessitino della sostituzione
di un tessuto o di un organo malato o
danneggiato.
47
Sono state proposte tre vie di clonazione
terapeutica, atte ad ottenere cellule staminali
umane pluripotenti con una ben definita
informazione genetica, cui far seguire la
differenziazione desiderata
48
1) trasferimento del nucleo di una cellula
somatica umana in un ovocita umano privato del
proprio nucleo, seguito dallo sviluppo
embrionale (blastocisti) prelievo della massa
cellulare interna e derivazione da questa delle
cellule staminali e quindi delle cellule
differenziate desiderate
2) trasferimento del nucleo di una cellula
somatica umana in un ovocita di altro animale
3) riprogrammazione del nucleo di una
cellula somatica fondendolo con il citoplasma di
una cellula staminale embrionale.
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(No Transcript)
50
(No Transcript)
51
Dati recentissimi della letteratura
(Letters di Nature on line) riportano i risultati
di esperimenti effettuati nel topo per ottenere
cellule staminali embrionali mediante nuclear
transfer con delle modifiche rispetto a quanto
illustrato precedentemente.
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Questi lavori avrebbero lo scopo di
conciliare gli interessi scientifici e le istanze
etiche nella speranza di generare anche un ampio
consenso sociale.
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a) Alterazione del nucleo del donatore per
ottenere una blastocisti incapace di impiantarsi
in utero ma capace di generare cellule staminali
embrionali
b) derivazione di cellule staminali da un
singolo blastomero di un embrione allo stadio di
8 cellule senza alterare lo sviluppo
dellembrione stesso.
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(No Transcript)
55
a, b, Clump of GFP-positive mES cells 48 h after
aggregation with single blastomeres arrow shows
a protruding cluster of GFP-negative cells. c, d,
Outgrowth of GFP-negative cells aggregated with
GFP-positive mES cells, after being plated on
MEFs arrows point to GFP-negative cells. e, f,
Passage 1 of the outgrowth arrows show remaining
GFP-positive mES cells. g, h, Single blastomere
outgrowth on MEFs for 4 days without ES cells,
stained with Troma-1 and DAPI. a, c, e, Green
fluorescence b, Hoffman modulation optics d, f,
phase contrast. Scale bar, 100 m.
56
PARADIGMA STANDARD DELLA DIFFERENZIAZIONE
57
Il differenziamento è la comparsa di differenze
morfologiche, biochimiche e funzionali tra le
cellule. Alcune di queste differenze sono
visibili con comuni mezzi di osservazione
(microscopio).
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La comparsa di differenze visibili è preceduta da
quella di differenze invisibili con le tecniche
tradizionali (determinazione).Per ogni tipo di
cellula è possibile individuare un periodo
critico prima del quale le cellule possono
cambiare il loro destino, ma dopo il quale esse
sono determinate a differenziarsi in un certo
modo.
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La determinazione implica anche il concetto di
memoria cellulare le cellule si ricordano di ciò
che è avvenuto nel periodo della determinazione e
rispondono agli stimoli ambientali non solo in
base al loro patrimonio genetico, ma anche in
base alla loro storia.
60
(No Transcript)
61
Il differenziamento si verifica sostanzialmente
nel corso dello sviluppo embrionale. Tuttavia,
esso si continua nel normale turnover cellulare e
nei processi riparativi. Complesse interazioni
si estrinsecano tra le cellule adiacenti.Le
cellule vanno incontro a una graduale restrizione
del potenziale differenziativo.
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Lo sviluppo è accompagnato da una gerarchia di
processi di differenziamento che va dalla
formazione dei 3 foglietti germinativi alla
produzione nelluomo di oltre 200 tipi di
cellule diverse.
Durante lo sviluppo si osservano peraltro
numerosi cambiamenti di forma che avvengono
attraverso migrazioni, ripiegamenti, tubulazioni,
invaginazioni, collettivamente noti con il
termine morfogenesi.
63
Nella proliferazione e nel differenziamento
cellulare sono coinvolti diversi fattori di
crescitaEGF, TGFs, FGFs, fattore BIG,
interleuchine, sostanza morfogenetica dellosso,
etc.
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Nel differenziamento degli arti sono anche
implicati i fattori Wnt, che a loro volta
inducono lespressione di alcuni geni della
famiglia Lim.
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Lacquisizione delle caratteristiche del blastema
metanefrico richiede lespressione del gene per
il fattore di trascrizione chiamato WT1. La
crescita del blastema richiede lespressione del
gene per il fattore di trascrizione chiamato
c-ret.
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Mutazioni di WT1 danno origine ad anomalie dello
sviluppo del rene, dellapparato genitale e a
tumori renali dellinfanzia. Questi tumori (di
Wilms) sono rari (8/1.000.000 di individui).
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Per la differenziazione del nefrone e la
formazione del glomerulo sono importanti Mox 1,
n-myc, Pax 2, Hoxc-9.
68
La decisione di una cellula dello strato
germinativo di rimanere a far parte del
contingente delle cellule che proliferano o di
spostarsi nello strato spinoso e proseguire nel
differenziamento dipende da un gran numero di
fattoriEGF, TGFs, HGF, calcio, acido retinoico,
fattore BIG (ligando del recettore ECK), IL-1,
IL-6.
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(No Transcript)
70
Il differenziamento è talvolta legato a induzioni
interattive specifiche che si esercitano tra
gemme di organi differenti.
71
Il differenziamento non spiega però tutto quello
che accade si originano delle diversità dovute
esclusivamente al fatto che gli stessi tipi di
cellule vanno a disporsi nello spazio in maniera
diversa.Esiste dunque il problema
dellorganizzazione spaziale (pattern).
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In realtà, le cellule ricevono due tipi di
informazioni diverse 1) destino istologico2)
destino spaziale (geni del pattern)
73
Il pattern è il progetto architettonico
dellindividuo, mentre la morfogenesi è linsieme
dei processi che realizzano il progetto.
74
Geni omeotici controllano il piano di formazione
del corpo.Omeogeni sono stati scoperti anche nei
vertebrati essi sono riconoscibili dalla
presenza dellomeobox, sequenza di 183 nucleotidi
contenuta nei geni.
75
Esiste una certa proprietà di correzione dalle
deviazioni (regolazione) e si pensa che
lembrione sia diviso in aree organogenetiche o
campi morfogenetici.
76
Totipotenza del germePossibilità di formare sia
i tessuti embrionali che quelli extraembrionali
(persa allo stadio di 8 blastomeri).
Totipotenza embrionaleCapacità di formare tutti
i tessuti dellembrionerimane più a lungo è
presente allo stadio di blastocisti.
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Gemelli monozigoti 1/3 totale1/3 ha 2 placente
(bicoriali),la separazione è avvenuta
precocemente quando entrambi i gruppi avevano la
capacità di formare il trofoblasto (primi 3
giorni)gli altri 2/3 hanno una placenta sola
(monocoriali).La grande maggioranza ha due
amnios.Una piccola minoranza (1-2) dei gemelli
identici ha un solo amnios.La separazione è
avvenuta dopo la formazione dellamnios II
settimana dello sviluppo.
78
Quanto esposto a proposito delle cellule
staminali tende a modificare il paradigma
standard della differenziazione !Si mira alla
TRANSDIFFERENZIAZIONE !
79
The hepatocyte-to-beta cell transdifferentiation
paradigm
80
Date le proprietà delle cellule staminali è ovvio
che esse siano importanti durante lo sviluppo e
il mantenimento dellomeostasi dellorganismo.

• Due fenomeni biologici significativi coinvolgono
  le cellule staminali
• Linvecchiamento
• Il cancro

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In condizioni fisiologiche le cellule staminali
presiedono al rinnovamento cellulare e, quando la
capacità replicativa tende ad esaurirsi, il
tessuto invecchia.
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A causa della lunga vita e della loro storia
replicativa le cellule staminali sono soggette a
danni indotti da fattori intra- o
extra-cellulari.
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Alcuni errori dovuti alla duplicazione del DNA
possono essere riparati, ma, a lungo andare, i
meccanismi di riparazione possono rivelarsi
inefficaci.
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Modelli di Tumorigenesi

• Modello semplificato a partire dalla
• cellula staminale
• sviluppo tumorale clonale unidirezionale.
• Tutte le cellule tumorali derivano dalla cellula
  staminale e contengono mutazioni riscontrabili in
  questa cellula.

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Modelli di Tumorigenesi
b) Modello di differenziazione dinamica
sviluppo tumorale clonale multidirezionale. Anche
in questo caso si trovano mutazioni nella
cellula staminale, ma il differenziamento può
estrinsecarsi in forme diverse e le cellule
possono andare incontro ad una fluttuazione lungo
la via differenziativa riesprimendo le
caratteristiche delle cellule progenitrici.
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Modelli di Tumorigenesi
c) Modello di reclutamento sviluppo tumorale
non clonale multidirezionale. Il tumore, non solo
contiene cellule staminali mutate, ma recluta
anche cellule normali che sono necessarie al suo
stesso sviluppo. Le cellule reclutate possono
avere mutazioni differenti da quelle espresse
nelle cellule staminali e possono essere
ingaggiate a differenti stadi della
differenziazione del cell lineage a cui
appartengono.
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(No Transcript)
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Stem cell model of mammary carcinogenesis
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(No Transcript)
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(No Transcript)
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Si ringraziano le Dott.sse Cristiana
Angelucci Fortunata Iacopino Silvia
Ferracuti Cecilia Giannitelli Per la
collaborazione offerta alla realizzazione di
questa presentazione.