Capacita

1
Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora
Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas
e Parasitárias Laboratórios Laboratório Central -
HSP - UNIFESP
Métodos de Teste de Sensibilidade
aosAntimicrobianos (TSA)
2
sair
3
Beta Lactâmicos
sair

• GRUPOS
• Penicilina
• Cefalosporinas
• Monobactâmicos aztreonam
• Carbapenêmicos imipenem meropenem
• ertapenem

Anel ?-lactâmico
O
Sítio de ação da ?-lactamase
4
Cefalosporinas
sair
3a Geração
1a Geração
Cefazolin
Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima
Ceftizoxima Ceftriaxona
2a Geração
Cefamandol Cefonicid Cefotetan Cefoxitina
Cefuroxima
4a Geração
Cefepima
5
RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS
sair
Aeróbios
Metronidazol
Natural ou intrínseca ou Constitutiva
Anaeróbios
Aminoglicosídeos
Mutação de genes
Adquirida
Cromossômica
Resistência única-não é transmitida de célula
para célula a menos que o gene esteja em integron
Produção ß-lactamases, fosfotransferases,
hidrolases, redutases.
Plasmidial
Transmissível
Resistência múltipla
6
Evolução Clínica
sair
Paciente
Imunidade
Farmacologia
Antimicrobiano
Microrganismo
Teste de sensibilidade
7
sair
Reprodução da placa de Fleming para a prova de
sensibilidade aos antibióticos
Reprodução da descoberta de Fleming
8
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
sair

• METODOLOGIAS
• Avaliação QUALITATIVA
• DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
• Avaliação QUANTITATIVA
• DILUIÇÃO EM CALDO
• Macrodiluição
• Microdiluição
• DILUIÇÃO EM ÁGAR
• AUTOMATIZADOS
• ETEST

9
MACRODILUIÇÃO
sair
Método quantitativo ? MIC
?g/mL
100 50 25 12.5
6.25 3.12 .16 .8
.4 controle

• Conceito
• Precisão
• Vantagens
• Desvantagens

10
MACRODILUIÇÃO EM CALDO
sair
11
Determinação do MIC
sair
?g/mL
12.5 6.25 3.12

• MIC
• É a menor concentração inibitória mínima que
  inibe completamente o crescimento bacteriano.

12
MACRODILUIÇÃO
sair
MIC
?g/mL
100 50 25 12.5
6.25 3.12 .16 . 8
.4 controle



MBC
13
MICRODILUIÇÃO
sair
14
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair

• Utilizado rotineiramente
• Fácil execução
• Flexibilidade na escolha dos antibióticos
• Reprodutibilidade nos resultados
• Padronização dos resultados
• Baixo custo

15
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
Princípio do método
16
Teste de sensibilidade aosantimicrobianos
sair
Leitura e Interpretação
mm
17
DILUIÇÃO EM ÁGAR
sair

• Utilizado em estudos epidemiológicos
• Fácil execução
• Permite testar vários isolados simultaneamente
• Promove resultados quantitativos
• Permite o teste de bactérias fastidiosas
• Baixo custo (relativo)
• Poucos isolados
• Preparo das placas e estocagem

18
DILUIÇÃO EM ÁGAR
sair
Ágar com 6 ?g/mL de Vancomicina
Enterococcus spp.
S ? ? 4 ?g/mL I ? 8-16 ?g/mL R ? ? 32 ?g/mL
19
Diluição em Ágar - Desvantagens
sair

• Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas
  quanto a preparação do inóculo, especialmente
  quando vários antimicrobianos devem ser testados
• As placas de ágar não podem ser armazenadas por
  muito tempo

Helio Sader - LEMC
20
Etest
sair
Princípio do método
21
Etest?Difusão
sair
22
Teste de sensibilidadeaos antimicrobianos
sair
Curva de regressão
23
Relação entre o MIC, Zona de inibição e
Breakpoints.
sair
24
MIC ?? DIFUSÃO
sair
100 50 25 12.5
6.25 3.12 .16 . 8
.4 controle
?g/mL
30
50 25 12.5 6.25 3.12
18 mm
25
Interpretação do Etest
sair
26
Interpretação do Etest
sair
27
Interpretação do Etest
sair
28
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY
STANDARDS CLSI - antigoNCCLS
sair

• Organização internacional, interdisciplinar e
  educacional que promove o desenvolvimento e a
  ampla utilização de normas e procedimentos
  laboratoriais padronizados.
• A subcomissão do CLSI é composta de
  representantes de profissões, do governo e
  indústria, incluindo laboratórios de
  microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

29
TESTE DE SENSISIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS
sair
Padronização

• Processos Padronizados (POPs)
• Controle de qualidade dos itens
• meios (efeito timidina ou timina)
• pH
• temperatura
• incubação
• discos (ATCCs)
• fitas de Etest

30
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Bactéria e Preparo do Inóculo

• Suspensão direta
• Método de crescimento
• 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL

31
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Bactéria e Inóculo
Bactéria recentemente isolada Colônias bem
isoladas
32
CRESCIMENTO BACTERIANO
sair
33
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
MEIOS
1- Ágar Mueller-Hinton 2- Ágar Mueller-Hinton
suplementado 3- Ágar GC 3- Haemophilus Test
Medium (HTM)
34
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
MEIO MUELLER- HINTON

• Reprodutibilidade do teste.
• Baixo teor de inibidores de sulfonamidas,
  trimetoprim
• e tetraciclinas.
• Permite crescimento satisfatório da maioria dos
  
• patógenos.
• Grande número de dados e experiência com o
  meio.

35
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
O que devemos saber sobre os meios?

• Hidratar e autoclavar
• 60 a 70 mL 150 mm
• 25 a 30 mL 90 mm
• pH 7.2 a 7.4
• Conservação 2 a 8oC
• Teste de esterilidade

4 mm

36
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
O que devemos saber sobre os meios?

• Umidade
• Efeito da Timidina ou Timina
• Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim.
• Conservação 2 a 8oC
• Teste de esterilidade
• Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio

37
TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR
sair
Discos

• Conservação 8oC ou ?
• freezer (não frost free)
• Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de
  ác.clavulânico
• Retirar do refrigerador ou do freezer até
  2 horas antes do uso
• Evitar umidade
• Data de validade

38
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
sair
Seleção dos antibióticos

• Laboratório Clínico
• Infectologistas
• Comissão de Infecção Hospitalar
• Comissão de Controle de Antimicrobianos
• Farmácia

39
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
sair
Quando e porquê realizar o antibiograma?

• Isolado requer terapia antimicrobiana
• Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva
• Isolado capaz de exibir resistência
• Orientação terapêutica
• Permite individualizar padrões de resistência

40
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Inóculo

• Métodos
• Crescimento
• Suspensão direta

41
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Inóculo - Método do crescimento

• 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB
• Incubar a 35oC - (2 a 6h)
• Ajustar a turbidez
• 0,5 McFarland
• 1a 2x108 UFC/mL

42
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Inóculo - Suspensão direta

• 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB ou
  salina
• Ajustar a turbidez
• 0,5 McFarland
• 1 a 2 x 108 UFC/mL
• Estabilizar 15 min.

43
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Inóculo
44
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Inoculação
45
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
Inoculação

• Superfície do ágar não deve estar úmida
• Inoculação homogênea
• Esperar diminuir a umidade antes da aplicação
  dos discos

46
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Aplicação dos discos

• Bateria pré determinada
• Aplicar e pressionar o disco
• Aplicar no máximo
• 12 discos na placa de 150mm
• 5 discos na placa de 90mm
• Inverter a placa e incubar 15 minutos após a
  aplicação

47
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Proce
dimento
sair
Incubação

• Temperatura 35oC
• Atmosfera atm ambiente
• exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e
  estreptococos
• CO2

48
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
sair
Leitura e Interpretação
49
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
O que testar? Como interpretar?
50
CLSI-2005
sair
A lista de cada microrganismo compreende agentes
de eficácia comprovada e que tem um comportamento
aceitável nas provas in vitro.

• Quais são os antibióticos devemos utilizar?
• Grupo A 1ª escolha - testados e reportados
• Grupo B 1ª escolha - testados e reportados
  seletivamente
• Grupo C suplementares e reportados
  seletivamente
• Grupo U testados em isolados de urina
• Grupo O outros não rotineiramente utilizados
• Grupo inv em investigação

51
CLSI
sair

• Recomendações na escolha dos antimicrobianos
• Padronização das técnicas
• Critérios para a interpretação dos resultados
• Parâmetros para o controle qualidade do teste.

52
Interpretação do Resultado
sair

• Susceptível (S)
• A categoria susceptível implica que a infecção
  causada pela cepa bacteriana isolada pode ser
  adequadamente tratada com a dosagem do
  antimicrobiano recomendada para o tipo de
  infecção e o agente infeccioso.
• Desde que não haja contra indicação.

53
Interpretação do Resultado
sair

• Intermediária (I)
• A categoria intermediária inclui isolados cujos
  MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela
  permite a aplicabilidade do antimicrobiano em
  infecções em sítios onde as drogas são
  fisiologicamente concentradas ou quando doses
  maiores podem ser utilizadas.

54
Interpretação do Resultado
sair

• Resistente (R)
• A categoria resistente inclui isolados que não
  são inibidos pelas concentrações usuais do
  antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha
  quando um específico mecanismo de resistência é
  expressado.

55
Avaliação da Sensibilidade Streptococcus
pneumoniae
sair

• Mueller-Hinton agar com 5 de sangue de
  carneiro
• Inóculo ? suspensão direta, 0,5 McFarland
• Incubação ? 35oC 2o em atm. 5 CO2
• Leitura ? 20 a 24h
• Controle de qualidade ? S.pneumoniae ATTC
  49619

CLSI, M100-S15, 2005
56
Avaliação da Sensibilidade Streptococcus
pneumoniae
sair

• Escolha dos discos ? Tabela 2G
• Oxacilina ? Penicilina
• não recomendado para outros estreptococos
• Diâmetros de inibição específicos (Tabela 2G)
• Interpretação
• Oxacilina ? 20 mm ? Sensível
• ? 19 mm
• penicilina, meropenem e
  ceftriaxona ou cefotaxima

MIC
CLSI, M100-S15, 2005
57
Streptococcus pneumoniae
sair
Azitromicina Claritromicina

• CLORANFENICOL 3
• ERITROMICINA 1
• OFLOXACINA
• OXACILINA 1?g ? PENICILINA 1
• RIFAMPICINA 3
• GATIFLOXACINA 3
• SULFA/TRIMET 1
• VANCOMICINA 2

Ampicilina, Amoxacilina, amoxacilina/ác.clav.
ampicilina/sulb., cefaclor, cefepima, cefotaxima,
ceftriaxona, cefuroxima, imipenem e meropenem
? 20mm S
Levofloxacina Moxifloxacina
lt 17 mm
Penicilina Meropenem Ceftriaxona
MIC
?19 mm
CLSI, M100-S15, 2005
58
Avaliação da Sensibilidade Streptococcus spp.
sair

• Mueller-Hinton agar com 5 de sangue de
  carneiro
• Inóculo ? suspensão direta
• Incubação ? 35oC 2o em atm. 5 CO2
• Leitura ? 20 a 24h
• Controle de qualidade ? S.pneumoniae ATTC
  49619

CLSI, M100-S15, 2005
59
Avaliação da Sensibilidade - Enterococos
sair

• Ágar Mueller-Hinton
• Inóculo ? crescimento ou suspensão direta
• Incubação ? 35oC 2o em atm. ambiente
• Leitura ? 16 a 18h,
• 24h para Vancomicina ? R

MIC
CLSI, M100-S15, 2005
60
Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE)
sair

• 1º Isolado
• final dos anos 80

30 anos após Vancomicina
gt 20 das infecções pelo Enterococo
61
Enterococcus resistente à Vancomicina (VRE)
sair

• Resistência Intrínseca
• Enterococcus gallinarum e E. casseliflavus
• Resistência adquirida
• Enterococcus faecium e E. faecalis

62
Detecção do pigmento - Enterococcus spp.
sair
BHIA
E. faecium E. faecalis E. gallinarum
E. mundii
Pigmento amarelo
Sim
Motilidade 30ºC
Negativo
Positivo
E. casseliflavus
63
Avaliação da sensibilidade dos Enterococcus spp.
sair
S
Imipenem E. faecalis

• AMPICILINA 1
• CIPROFLOXACINA U
• CLORANFENICOL 3
• GENTAMICINA 120 ?g 3
• STREPTOMICINA 300 ?g 3
• TEICOPLANINA
• VANCOMICINA 2
• QUINUPRISTIN/DALFOPRISTIN 2

Penicilina
S
Amoxicilina, Amoxacilina/ác.clav.,
ampicilina/sulbactan, piperacilina e
piperacilina/tazobactan. Para cepas não
produtoras de ? lactamases
24 h de incubação
15-16 mm ? MIC
Sinergismo positivo Sinergismo negativo
Detecção de ? lactamases

7-9 mm ? MIC
R? Penicilina
E. faecalis ATTC 29212
CLSI.M100 -S15, 2005
64
VRE
sair


65
Avaliação da Sensibilidade Estafilococos
sair

• Ágar Mueller-Hinton
• Inóculo ? suspensão direta
• Incubação ? 33 a 35oC em atm. ambiente
• Leitura ? 16 a 18
• 24h ? Oxacilina/Cefoxitina e Vancomicina

MRSA e MRS
CLSI, S15, 2005
66
Staphylococcus aureus
Staphylococcus não aureus
sair
CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GEN
TAMICINA 3 OXACILINA 1?g 1 CEFOXITINA PENICILINA
1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Qui
nupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3
CIPROFLOXACINA 3 CLINDAMICINA 2 ERITROMICINA 2 GEN
TAMICINA 3 OXACILINA 1?g 1 CEFOXITINA PENICILINA
1 SULFA/TRIMET 2 TEICOPLANINA VANCOMICINA 2 Qui
nupristin/Dalfopristin 3 LINEZOLIDA 3
Levofloxacina Ofloxacina
Azitromicina Claritromicina Rotineiramente não
são reportado em urina
lt14mm ? MIC
MRSA
MRS
Gene mec A
As penicilinas, cefens e outros ? lactâmicos como
amoxi/ác.clav., ampi/sulb., ticarcilina/ác.clav.
e carbapenems
Oxa R ? PR
Oxa s e PS ? S
Oxa s e PR ? ? lactamase
CLSI, S15, 2005
67
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY
STANDARDS NCCLS- 2001
sair
Staphylococcus spp.

• Vancomicina
• halo ? 14 mm MIC
• Incubação
  por 24horas a 33 a 35C
• MIC ? 4 ?g

Encaminhar a Laboratório de Referência
68
Detecção do VISA e VRSA
sair
Diluição em ágar
BHIA 6 ?g/mL Vancomicina
69
Detecção do VISA e VRSA
sair
E-test
70
Avaliação da Sensibilidade Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas
maltophilia e Burkholderia cepacia
sair

• Ágar Mueller-Hinton
• Inóculo ? método do crescimento ou suspensão
  direta
• Incubação ? 35oC 2o em atm. ambiente
• Leitura ? 16 a 18h
• Controle de qualidade ? P. aeruginosa ATTC
  27853
• ? E. coli ATTC 35218
• ? E. coli ATTC 25922

S. maltophilia e B. cepacia ? 20 a 24
horas P. aeruginosa na Fibrose cística
CLSI.M100 -S15, 2005
71
Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter
spp.
sair

• AMICACINA 2
• TOBRAMICINA 2
• GENTAMICINA 1
• CEFEPIMA 2
• CEFTAZIDIMA 1
• CIPROFLOXACINA 2
• IMIPENEM 2
• MEROPENEM 2
• PIPERACILINA 1
• TICARCICINA 1
• PIPE/Tazo O
• TICARC/ Ác.clav. O
• POLIMIXINA

AMICACINA 2 GENTAMICINA 1 AMPICILINA/Subac. CEFEPI
MA 2 CEFTAZIDIMA 1 CEFTRIAXONA 3 CIPROFLOXACINA
2 IMIPENEM 2 MEROPENEM 2 PIPERACILINA 1 TICARCICI
NA 1 PIPE/Tazo O TICARC/ Ác.clav. O POLIMIXINA
Cefotaxima
Levofloxacina
Pode ser reportado quando a cepa for resistente
CLSI,M100 -S15, 2005
72
Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia
cepacia
sair
CEFTAZIDIMA 1 MEROPENEM 2 MINOCICLINA 0 TR
IMETOPRIM - SULFAMETOXAZOL 3
LEVOFLOXACINA 2 MINOCICLINA 0 TRIMETOPRIM -
SULFAMETOXAZOL 3
CLSI.M100 -S15, 2005
73
Avaliação da Sensibilidade Enterobactérias
sair

• Ágar Mueller-Hinton
• Inóculo ? método de crescimento e suspensão
  direta
• Incubação ? 35oC 2o em atm. ambiente
• Leitura ? 16 a 18h
• Controle de qualidade ? E. coli ATTC 25922
• ? E. coli ATTC 35218

NCCLS.M100 -S15, 2005
74
Enterobactérias
sair

• AMICACINA 2
• AMPICILINA 1
• AMPICILINA/Sulbactan 2
• AZTREONAM 3
• CEFALOTINA 1
• CEFEPIMA 2
• CEFTAZIDIME 3
• CEFOXITINA 2
• CEFTRIAXONA 2
• CIPROFLOXACINA 2
• GENTAMICINA 1
• IMIPENEM 2
• ERTAPENEM 2
• PIPERACILINA/Tazobactan 2
• SULFA/TRIMET 2
• TICARCILINA/Äc.clavulânico2

Amoxacilina
Amoxacilina/ác.clavulânico
Cefotaxima
Levofloxacina
Meropenem
CLSI.M100 -S15, 2005
75
Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp
sair

• Ágar Haemophilus Test Medium (HTM)
• Inóculo ? suspensão direta
• Incubação ? 35oC em atm. 5 CO2
• Leitura ? 16 a 18h
• Controle de qualidade ? H. influenzae ATTC
  49247
• ? H. influenzae ATTC 49766
• ? E. coli ATTC 39218

NCCLS.M100 -S15, 2005
76
Avaliação da Sensibilidade Haemophilus spp
sair

• Ágar Haemophilus Test Medium
• Inóculo ? suspensão direta
• Incubação ? 35oC em atm. 5 CO2
• Leitura ? 16 a 18

O teste Positivo é preditivo de resistência à
penicilina, ampicilina e amoxacilina
77
Neisseria gonorrhoeae
sair

• Suspeita de falência terapêutica
• Vigilância
• Estudos para orientar terapia empírica

NCCLS.M100 -S15, 2005
78
RESISTÊNCIA INTRÍNSECA
sair
CEFOXITINA

• C. freundii
• Enterobacter spp
• Serratia spp

Amp/A.clavulânico e Amp/sulbactam

• Citrobacter spp
• Enterobacter spp
• Serratia spp

Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
79
RESISTÊNCIA INTRÍNSECA
sair
Enterobacteriaceae

• Citrobacter freundii
• Enterobacter spp
• M. morgani
• P. vulgaris
• P. penneri
• Providencia spp
• Serratia spp
• Yersinia enterocolitica

CEFALOTINA
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
80
RESISTÊNCIA INTRÍNSECA
sair
Enterobacteriaceae

• Citrobacter freundii
• Enterobacter spp
• Klebsiella spp
• M. morgani
• P. vulgaris
• P. penneri
• Providencia spp
• Serratia spp
• Yersinia spp

AMPICILINA
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
81
Perfis encontrados nos testes de sensibilidade
que requerem nova avaliação da amostra.
sair
Microrganismos Perfil de sensibilidade a ser
investigado Enterobacteriacea Resistência a
carbapenems E. coli e K. pneumoniae
Resistência às cefalosporinas de 3ª geração
ou monobactans P.aeruginos
a e A.baumannii Resistência à polimixina S.
maltophillia Sensibilidade aos carbapenems e/ou
resistência ao sulfam/trimetoprim N.
meningitidis Resistência à penicilina N.
gonorrhoeae Resistência à ceftriaxona
Man Clin Microb, 7ªedição, 1999
82
Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos
sair

• A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos
  representa uma das tarefas mais importantes do
  laboratório de microbiologia.
• O constante aparecimento de novos mecanismos
  bacterianos de resistência e novos
  antimicrobianos tornam os testes cada vez mais
  complexos
• É necessário uma atualização constante dos
  protocolos e a freqüente implementação de novos
  testes e metodologias.
• Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos
  assistentes são obrigados a estarem em constante
  atualização

83
Muito obrigada!
sair
Antonia Maria de Oliveira Machado amachado-labc_at_dh
sp.epm.br