Proteom Analyse von Endosomen

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Proteom Analyse von Endosomen
Fialka et al. 1999 Electrophoresis 20
331-343 Fialka et al. 1999 J. Biol. Chem. 274
26233-26239 Gagescu et al. 2000 Mol. Biol.
Cell 11 2775-2791 Huber et al. 2000 Traffic 1
494-503 Wunderlich et al. 2001 J. Cell Biol.,
152 765-776
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Identifikation von Proteinen an dezenten
zellulären Kompartimenten
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2-D or not 2-D.

• Nur ein kleiner Teil des Proteoms kann mit 2-D
  Gelen erfasst werden
• Daher sind neue Ansätze nötig
• Vielversprechende Entwicklungen basieren auf
  Chromatographie in Kombination mit Massen
  Spektrometrie, mit der klaren Intention 2-D Gele
  zu ersetzen

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Gel-unabhängige Techniken (I)Mehrdimensionale
Chromatographie
Komplexes Protein Gemisch
1. Säule Kationen Austauscher
2. Säule Phasen Material
Off-line Laden der Säule
kv
Elektrospray Ionisierung Ionenfallen Massen
Spektrometer
HPLC Gradient
Abfall/Aufteilung
Nat Biotechnol 2001 Mar19(3)242-7 Large-scale
analysis of the yeast proteome by
multidimensional protein identification
technology. Washburn MP, Wolters D, Yates JR 3rd
Datenbak Suche
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Ein wiedererwachtes Interesse an
Mehr-dimensionaler Chromatographie

• 1484 Proteine in einem Durchgang identifiziert
• 131 Proteine mit drei oder mehr transmembran
  Domänen
• Viele low abundance und Organellen Proteine
• Proteine mit extremen pI and MW
• Auflösung ähnlich hoch wie bei 2D-Gelen, aber
  ohne Selektion gegen Membranproteine und andere
  rare Spezies

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Gel-unabhängige Techniken (II) ICAT
SH-Reagenz
SH-Reagenz
Linker
Deuterium Linker (schwerer)
Biotin
Biotin

• Aebersold et al. Haben ein Biotin-Isotop
  markiertes affinity tag (or ICAT) erfunden
  dieses reagiert spezifisch mit der Aminosäure
  Cystein
• Wenn eine Probe mit schwerem ICATs (Deuterium)
  und die andere Probe mit leichtem ICAT markiert
  werden, ist es möglich diese zwei Proben durch
  die Masse zu unterscheiden
• Peak-Höhe korreliert mit vorhandener Menge

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• Voreingenommen (Cystein)
• Proteinmodifikationen
• Isoformen
• Sehr komplexe Analysen

• Automatisierbar
• Erster wirklich quantitativer MS Ansatz

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Protein Chip

• Im Gegensatz zu DNA basierenden Techniken ist
  dieser Ansatz noch in den Kinderschuhen
• Tausende Antikörper nötig (Antikörper-Chip)
• Tausende Proteine in gereinigter und aktiver Form
  nötig (Protein-Chip)
• Wie spezifisch werden diese Interaktionen in
  artifizieller biochemischer Umgebung sein?

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thoroughput rather than throughput